搜风祛痰中药对大鼠心肌缺血再灌注冠脉微循环内皮屏障的保护作用

肖福龙 宫丽鸿 姜 丹

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

近年来，人们认识到整个冠状动脉循环的结构和功能，包括微循环和心外膜冠状动脉，均会影响患者的症状和预后。与冠脉微循环相关的疾病即为冠脉微循环障碍（CMD）。有充分证据表明［1］血管内皮功能障碍是CMD的重要原因。研究表明［2］急性心肌梗死再灌注可诱导内皮屏障功能发生障碍，造成冠状微循环损伤。前期研究表明搜风祛痰中药具有改善内皮功能等作用［3-4］。因此本研究采用缺血再灌注模型从内皮屏障角度观察中药对于缺血再灌注模型大鼠冠脉微循环的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择体质量为（240±20）g的SPF级雄性SD大鼠140只，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供［许可证号：SYXK（辽）2013-0009］。

1.2 实验药物 搜风祛痰中药：陈皮15 g，法半夏15 g，白术 15 g，全蝎5 g，蜈蚣 1条，地龙 20 g，水蛭15 g。由辽宁中医药大学附属医院中药局提供，加工制成含生药2 g/mL中药浓缩液备用。培哚普利片［8 mg/片，施维雅（天津）制药有限公司，国药准字号H20103382］。

1.3 试剂与仪器 前列环素、血栓素A2（TXA2）试剂盒（AMEKO）；柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒（Sangon Biotech）；BioEasy Master Mix试剂盒（博日科技）；cDNA反转录试剂盒（Vazyme）；微量核酸蛋白测定仪（BioDrop）；PCR扩增仪（GeneAmp）；荧光定量PCR仪（Agilent Technologies）

1.4 分组与造模［5］将SD大鼠适应性喂养7 d，随机分为假手术组、模型组、培哚普利组、搜风祛痰中药组4组，每组35只。将雄性SD大鼠以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉注射，气管插管，接动物呼吸机，于左侧第3～4肋间切开皮肤，钝性分离肌层，打开胸腔，充分暴露心脏，用带线缝合针在左心耳与肺动脉圆锥之间于左心耳根部下方约2 mm处进针，将左前降支连同少量的心肌组织一起结扎，用血管钳夹紧闭合胸腔，实验中观察大鼠呼吸、心率变化。手术过程严格执行无菌操作。缺血30 min，再灌注120 min，制备大鼠心肌缺血再灌注模型。结扎成功的标志为心电图显示ST段抬高，计时心肌缺血30 min末剪断结扎线，再灌注时长为120 min，恢复冠脉血流，抬高的ST段下降1/2以上为大鼠心肌缺血再灌注模型造模成功。

1.5 给药方法 根据成人每日用药临床推荐的常用剂量，按成人与大鼠体质量折算系数6.3折算成大鼠用量后给药。其中假手术组、模型组大鼠予以生理盐水10 mL/kg灌胃；搜风祛痰中药组大鼠予以搜风祛痰中药8.1 g/kg灌胃（前期研究结果）［6］；培哚普利组予以培哚普利片0.4 mg/kg灌胃。建立心肌缺血再灌注模型1 h前给予药物治疗，假手术组与其他3组手术过程相同，但不结扎。

1.6 标本采集 造模成功后进行取材，取材前夜禁食，经大鼠腹主动脉取血，静置后离心，取上清液-20℃保存备用；取血结束后即刻处死大鼠，无菌条件下取出心脏，经多聚甲醛固定，置于液氮中，-20℃冻存备用。

1.7 指标检测 1）心电图。将大鼠用水合氯醛麻醉后，仰卧固定在手术板上，头颈部自然伸直并固定，确定各电极位置后将电极插入相应大鼠皮肤内，分别于大鼠造模缺血时、再灌注时进行心电图检测。2）ELISA法：检测TXA2、前列环素（PGI2）含量，具体操作按照试剂盒说明进行。3）RT-PCR法：测定内皮细胞蛋白C受体（EPCR）、血栓调节蛋白（TM）mRNA，利用柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒提取总RNA，cDNA反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。建立荧光PCR反应体系并进行扩增反应。EPCR引物序列：上游为 5′-GCAAAACACCAAAGGGAGCC-3′，下游 为 5′-ACAGCCCATCAGGATACCCA-3′，长度为 70 bp。TM引物序列：上游为5′-TGAGTGCAGTCAAGGCGAAT-3′，下游为5′-GAACAGGGATGGGGTCACAG-3′，长度为128 bp。进行基因相对定量分析。

1.8 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（）表示。各组间比较用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 大鼠情况 注射麻醉药物后大鼠死亡3只，手术过程中假手术组死亡10只，造模过程中死亡38只。总计造模成功42只（模型组16只、培哚普利组12只、搜风祛痰组14只）、假手术组25只。

2.2 各组大鼠PGI2、TXA2含量比较 见表1。与假手术组比较，模型组PGI2含量降低、TXA2含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，培哚普利组和搜风祛痰中药组PGI2含量均增高、TXA2含量均降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠PGI2、TXA2含量比较（ng/L，±s）

表1 各组大鼠PGI2、TXA2含量比较（ng/L，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同

组别假手术组模型组培哚普利组搜风祛痰中药组n 25 16 12 14 PGI2 68.484±1.95 32.44±1.918*58.257±5.934△54.507±5.351△TXA2 35.141±0.711 62.258±5.785*42.471±1.012△49.514±3.426△

2.3 各组大鼠TM、EPCR mRNA表达水平比较 见表2。与假手术组比较，模型组大鼠TM、EPCR mRNA表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，培哚普利组和搜风祛痰中药组大鼠均能降低TM、EPCR mRNA表达水平（P＜0.05）。

3讨论

PCI后出现无复流、慢复流是其严重并发症，这种现象会加重患者死亡风险［7］。发生原因主要是PCI后容易发生微血管栓塞和微血管功能改变，冠状动脉不稳定斑块的破裂、斑块碎片、微栓子、中性粒细胞-血小板聚集物导致冠脉微循环栓塞或再灌注血流引起氧自由基增多等损伤血管内皮细胞加重微循环障碍［8］。因此可从保护内皮屏障角度论治冠脉微循环障碍。冠脉微循环是由心脏前小动脉（100～400 μm）、壁间小动脉（＜100 μm）和冠状毛细血管床（＜10 μm）构成［9］，当冠脉微循环系统受到一种或多种不良因素影响出现异常后即发生冠脉微循环障碍［10］。

表2 各组大鼠TM、EPCR mRNA表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠TM、EPCR mRNA表达水平比较（±s）

组别假手术组模型组培哚普利组搜风祛痰中药组n 25 16 12 14 TM mRNA 1.005±0.0849 3.629±0.427*1.935±0.127△2.71±0.0656△EPCR mRNA 1.006±0.161 9.192±0.231*1.642±0.282△1.925±0.191△

目前国内外尚缺乏明确安全且有效的干预冠脉微循环障碍药物，中医药为冠脉微循环障碍的治疗提供了新思路。CMD这一病名，根据其临床表现，可以归属到中医学“胸痹”等病。宫丽鸿教授认为患者运动减少，饮食膏粱厚味致使脾虚生痰，痰凝血瘀，痰瘀蕴结不解而生内痈毒热，热极生内风，风邪为百病之长，善行而数变，痰风内动［11］，筋脉失养，挛急刚劲，与冠脉微循环障碍的发病机制血栓阻塞、血管痉挛有相似之处，故以“风痰理论”为基础，予以搜风祛痰中药，方中全蝎息风止痉通络散结；蜈蚣息风止痉、通络止痛；地龙息风止痉、平喘通络；白术、法半夏、陈皮合用，既可宽胸理气，又可燥湿化痰；水蛭破血逐瘀通经，共奏搜风祛痰、祛瘀通络之效。药理方面，全蝎、蜈蚣、地龙具有抗血小板聚集、抗凝、保护内皮细胞损伤、改善血液流变学指标等作用［12-15］，陈皮能抗血栓、抗炎、抗氧化、降血脂等作用［16］。

培哚普利片是长效的血管紧张素转换酶抑制剂，血管紧张素转换酶抑制剂可促进病变的冠状小动脉结构修复，故选择培哚普利片作为阳性对照药物［17］。TM和EPCR属于糖蛋白，均位于内皮细胞膜上，可反映内皮屏障损伤，对维持微血管内环境稳定具有重要作用［18］。缺血再灌注损伤时由于缺血缺氧等因素可造成心肌微血管内皮细胞损伤，屏障功能受损［19］，引起血管通透性增加，导致微血管功能障碍。本研究结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠TM、EPCR mRNA表达水平升高，说明冠脉微循环障碍发生时内皮屏障受到损伤。与模型组比较，搜风祛痰中药可降低TM、EPCR mRNA表达，说明搜风祛痰中药具有保护内皮屏障作用。TXA2和PGI2可由血管内皮细胞合成［20-21］，属于血管活性物质。PGI2与平滑肌上的IP受体结合具有强烈的舒张血管作用，TXA2具有收缩血管作用，PGI2和TXA2之间的平衡对冠脉微血管的收缩和舒张有着重要的调节作用。本研究结果显示：模型组PGI2含量下降，TXA2含量升高，表明微血管收缩与舒张物质失衡。与模型组比较，搜风祛痰中药通过调节血管收缩和舒张活性物质之间的平衡，改善微血管痉挛，增加心肌供血，改善受损内皮屏障功能从而达到修复心肌微循环目的。

综上所述，搜风祛痰中药可降低TM、EPCR mRNA表达水平，降低TXA2含量、升高PGI2含量，从保护内皮屏障功能角度调节冠脉微循环可能是其治疗冠脉微循环障碍的机制之一。搜风祛痰中药具体如何发挥保护内皮屏障作用，还需要进一步研究。