双亚苄基哌啶RA190阻滞HL60细胞于G0/G1期并诱导细胞凋亡

郑晓辉，徐淑娟，黄家福，林振兴， 祝珊珊，许雅苹，马丽娟，黄黎月

(1. 厦门医学院机能与临床转化福建省高校重点实验室,福建 厦门 361023；2. 福建医科大学附属协和医院血液科,福建福州 350001；3. 南方医科大学南方医院血液科，广东 广州 511436; 4. 厦门医学院科学实验中心,福建 厦门 361023)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是具有明显遗传异质性的临床侵袭性疾病。靶向异常基因治疗是当前研究热点。黏附调节分子1(adhesion regulating molecule 1，ADRM1)亦被称为 hRpnl3(human Rpn13)，是26S蛋白酶体亚单位19S调节颗粒上两个主要泛素受体之一，决定26S蛋白酶体结构不对称性。该蛋白在多细胞真核生物内高度保守，在生命过程中可能发挥重要功能。有研究表明[1-3]，ADRM1在肝癌、胃癌、急性白血病等多种恶性肿瘤中过表达，下调ADRM1蛋白水平可明显抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡。因此，ADRM1可能成为肿瘤治疗靶点。

双亚苄基哌啶RA190是近几年研究发现的ADRM1抑制剂，通过与ADRM1的半胱氨酸88共价结合，抑制蛋白酶功能[4]。本实验拟通过检测不同浓度RA190作用下HL60细胞活率，分析细胞周期与凋亡及ADRM1蛋白水平，以了解RA190在AML中作用机制，为AML治疗采用靶向ADRM1策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料人急性粒细胞白血病部分分化型细胞HL60为本实验室保存。RA190(MCE)；PI(KeyGEN Biotech)；Annexin V FLUOS Staining Kit(Roche)；Western blot抗体(CST公司)；RPMI 1640培养基(Corning)；胎牛血清(Gemini)。流式细胞仪EPICSXL(BECKMAN COULTER)。

1.2 方法

1.2.1细胞毒性实验 设不同浓度RA190(终浓度0.5、1、2、4 μmol·L-1)实验组和空白对照组，采用台盼蓝拒染法于细胞自动计数板上计数。

1.2.2流式细胞术检测细胞周期与凋亡 设不同浓度RA190实验组(0.5、1 μmol·L-1)和空白对照组，按照PI及Annexin V FLUOS Staining Kit试剂盒说明书操作。

1.2.3Western blot检测细胞内蛋白表达 收集各组细胞，PBS洗2次，加入RIPA细胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF、1 mmol·L-1正钒酸钠、10 mg·L-1抑肽酶)提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，取40 μg总蛋白进行Western blot实验。10% SDS-PAGE电泳后，转膜，分别用β-actin、ADRM1、Cyclin B1一抗与膜上的抗原结合，然后用HRP偶联的二抗与其反应，用ECL化学发光试剂检测，经压片曝光后，显影和定影。比较各组蛋白表达情况。

2 结果

2.1 RA190对HL60细胞增殖的影响随RA190浓度提高，HL60细胞活率降低(Tab 1)，说明RA190抑制HL60细胞增殖，半抑制浓度(IC50)约为3.1 μmol·L-1。

Tab 1 Viability of HL60 cells treated with differentconcentrations of RA190 for 24

2.2 RA190阻滞HL60细胞于G0/G1期RA190作用下，HL60细胞G0/G1期比率比空白对照组明显增加(P<0.05)，见Tab 2。

Tab 2 Cell cycle and apoptosis of HL60 treated with different concentrations of

*P<0.05vsRA190 0 μmol·L-1

2.3 RA190促进HL60细胞凋亡Tab 2结果显示，随着RA190浓度提高，HL60细胞早期与晚期凋亡均增加(P<0.05)。

2.4 RA190对ADRM1蛋白水平影响由于RA190诱导HL60细胞G0/G1期阻滞，本实验检测了Cyclin B1蛋白水平。结果显示，实验组细胞ADRM1与Cyclin B1蛋白表达均减少。

3 讨论

研究表明[4-5]，双亚苄基哌啶RA190与泛素受体ADRM1结合后，快速触发多泛素蛋白累积，诱导对硼替佐米耐药的多发性骨髓瘤细胞凋亡，也抑制卵巢癌、肝癌等多种肿瘤细胞增殖。本实验中，随RA190浓度提高，HL60细胞活率下降、凋亡增加、G1期停滞，说明RA190对HL60细胞具有明显毒性；此时细胞内ADRM1和Cyclin B1蛋白减少。这与预期及其他学者研究结果一致。

ADRM1募集UCH37形成ADRM1/UCH37复合物，介导NF-κB降解与活性，参与细胞周期和凋亡过程。UCH37通过影响Bax/Bcl-2比率和caspase-9、caspase-3酶活性，抑制细胞凋亡；NF-κB转录因子对绝大多数恶性肿瘤具有促癌作用。因此，ADRM1可能通过UCH37抑制HL60细胞凋亡，也可能通过NF-κB信号通路起作用。

肿瘤细胞增殖加速常伴随细胞周期改变，而细胞周期受周期调控蛋白影响。哺乳动物细胞中，Cyclin B从G1期晚期开始表达并逐渐积累，到G2期后期达到最大值，并一直维持到M期中期后迅速降解。RA190作用下，细胞内Cyclin B1蛋白表达减少，阻滞细胞从G1期进入S期，其机制是RA190的直接作用，还是ADRM1表达减少导致？有待后续研究。