珍珠烫伤膏干预小鼠溃疡性结肠炎的作用研究

董远　来要良　马致洁　刘永　赵奎君

摘要 目的：探讨珍珠烫伤膏对葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium，DSS）诱导小鼠肠道炎性反应的疗效。方法：采用DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）模型，随机分为空白组、模型组、美沙拉嗪（Mesalazine，Mes）组和珍珠烫伤膏（Pearl Scald Ointment，Pso）低（Pso1）、高剂量组（Pso2），每组10只。给药10 d，观察并分析小鼠体质量、结肠长度、病理评分及炎性反应因子等方面的变化。结果：与模型组比较，珍珠烫伤膏各剂量组小鼠的疾病活动指数、结肠病变评分、HE染色病变评分及炎性反应因子水平均显著下降，由UC引起的体质量及结肠长度缩短均有所改善，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：珍珠烫伤膏对DSS诱导的溃疡性结肠炎有显著地改善作用，提示其对溃疡性结肠炎有一定的治疗作用。

关键词 珍珠烫伤膏;溃疡性结肠炎;灌肠疗法;葡聚糖硫酸钠;美沙拉嗪;疾病活动指数;肿瘤坏死因子;白细胞介素-6;中药

Therapeutic Effects of Pearl Scald Ointment in Rats with Ulcerative Colitis

Dong Yuan1，Lai Yaoliang2，Ma Zhijie1，Liu Yong2，Zhao Kuijun1

（1 Department of Chinese Pharmacy，Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100050，China; 2 Beijing Xuanwu Traditional Chinese Medical Hospital，Beijing 100000，China）

Abstract Objective：To explore the therapeutic effects of Pearl Scald Ointment in rats with ulcerative colitis（UC）induced by dextran sulfate sodium（DSS）. Methods：The UC rats induced by DSS were randomly divided into the normal control（NC）group，model group，Mesalazine（Mes）group，low and high dose groups of Pearl Scald Ointment（Pso）with 10 rats per group. After administration for 10 days，the changes of body weight，colon length，pathological scores and inflammatory factors in rats were observed and analyzed. Results：Compared with the model group，the disease activity indexes，colon lesion scores，HE staining lesion scores and levels of inflammatory factors of rats in each dose group of Pso were significantly decreased. The body weight and shorted colon length caused by UC were improved with statistically significant differences（P<0.05）. Conclusion：Pso has significant improvement effects on rats with UC induced by DSS，which suggests that it has a certain therapeutic effects on rats with UC.

Key Words Pearl Scald Ointment; Ulcerative colitis; Enema therapy; Dextran Sulfate Sodium; Mesalazine; Disease activity indexes; Tumor necrosis factor; Interleukin-6; Herbal medicine

中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.017

溃疡性结肠炎是一种不明原因的直肠和结肠的慢性非特异性炎性反应。主要临床表现有：反复腹痛、腹泻、黏液样血便等[1]。UC的发病机制尚不明确，一般认为与免疫、遗传和炎性反应因子等因素有关[2]。现代医学治疗主要以氨基水杨酸类、糖皮质激素类及免疫制剂类药物为主。这些药物虽然疗效明确，但是也伴随着不良反应大、易耐药以及在部分顽固性病例上疗效不理想等问题[3]。近些年研发的生物、免疫制剂等新型药物也因其价格昂贵、易复发等原因，难以完全满足临床使用的需要[4]。因此，寻找更加安全、有效、廉价的药物和治疗手段成为近些年研究的重点。

珍珠烫伤膏为北京市宣武中医医院院内制剂，其主要由黄芩、黄连、黄柏、大黄、珍珠粉、地龙等药物组成，具有抗感染，止痛，促进创伤愈合等功效，主要用于烧伤创面的治疗。而临床中发现，使用珍珠烫伤膏灌肠治疗溃疡性结肠炎的疗效良好，并具有减少肠道刺激、避免复发等优势[5]，其在多年的治疗使用中积累了丰富的临床经验，但目前尚缺乏针对性的基础研究。

本文采用DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型，观察并分析实验前后小鼠体质量、结肠长度、DAI评分、病理评分、炎性因子等方面的变化，以期明确珍珠烫伤膏对溃疡性结肠炎的治疗作用，为临床的经验用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级C57小鼠，8周龄，雄性，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）-2016-0002。动物饲养环境为清洁级实验动物房，20～22 ℃，40%～70% 12 h黑暗/光照循环。动物饲养使用的标准鼠饲料和水以及所有动物实验均按照首都医科大学附属北京友谊医院动物伦理委员会相关规定进行。

1.1.2 药物 珍珠烫伤膏（北京市宣武中医医院药剂科提供，生产批号：171123），美沙拉秦肠溶片（Losan Pharma GmbH，德国，生产批号：18A19）。

1.1.3 试剂与仪器 硫酸葡聚糖（Dextran sulphate sodium，36000-50000，MP公司，美国，31404），小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒（eBioscience公司，美国，批号：4331720）;小鼠IL-6酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（湛江科联生物技术有限公司，批号：221070422）、多聚甲醛（万华化学（宁波）有限公司，20180301）。电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，型号：PL-203）;超纯水器（Millipore Inc，法国，型号：A10）;SpectraMax酶标仪（Molecular Devices，美国，型号：M3）;超低温冰箱（Thermo electron，美国，型号：Forma-86C）;锅旋混合器（上海医科大学仪器厂，型号：XW-80C）;高速组织匀浆机（IKA，德国，型号：T10）;Leica石蜡切片机（上海莱卡仪器有限公司，型号：RM2016）;光学显微镜（Olympus公司，日本，型号：CKX41）

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 C57小鼠，随机分为5组：正常组、DSS诱导的UC模型组，阳性药组美沙拉组，Pso低剂量组和Pso高剂量组。每组动物10只。实验时间一共为10 d，给药期及造模期时间和药物用法用量如表1和图1所示，正常组及模型组给予相同体积的生理盐水。模型组小鼠自由饮用2.5%的DSS溶液7 d（每只小鼠每天平均饮水量约为4.3～4.5 mL）[6]。正常饮水饮食，每天更换垫料，保证室温20～22 ℃造模过程中，每天观察小鼠状态，记录体质量，摄食量。

1.2.2 给药方法 阳性药组给以美沙拉嗪肠溶片[50 mg/（kg·d）]，Pso低剂量组给以珍珠烫伤膏5 g/（kg·d）（采用人与小鼠给药剂量方法折算出小鼠给药的等效剂量），Pso高剂量组[10 g/（kg·d）]。珍珠烫伤膏采用38 ℃加热溶化后灌肠给药[7]。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 疾病活动指数（DAI）评价 在整个实验过程中，每天9：00及15：00定时检查小鼠的精神、活动及排便情况，并对小鼠精神状态、粪便软硬程度及粪便隐血情况进行记录，2次/d。根据结果进行疾病活动指数评价。疾病活动指数评价：在造模及给药期间，每天观察并记录小鼠的体质量变化、粪便性状及便血情况，按照疾病活动指数（DAI）评分标准进行评分。见表2。评分依据为：黏着于肛门的水样便为稀便，不黏着于肛门的糊状大便为半稀便，成型大便为正常便。计算方法为：DAI=（体质量下降分值+粪便性状分值+便血情况分值）/3[8]。

1.2.3.2 结肠长度测定 第10天处死小鼠，取出结肠，用标尺测量结肠长度变化。计算各组平均值及标准偏差，进行相关统计分析。

1.2.3.3 结肠病变评分 第10天处死各组小鼠，取出整段结肠并纵行剖开，用冷生理盐水冲洗清洁数次，滤纸滤干，展开平铺并用大头针固定，肉眼观察结肠黏膜炎性反应及溃疡情况，参照表3所列标准进行评分[9]。

1.2.3.4 结肠HE染色及病变评分 取结肠组织，用生理盐水冲洗肠腔，用4%多聚甲醛固定12 h，常规石蜡包埋、切片、HE染色。染色后观察组织学改变，根据上皮细胞形态、多少及炎性反应细胞浸润情况，参照评分标准进行盲法评分[10]。见表4。以小鼠组织学评分作为判断炎性反应程度的主要标准，由于正常小鼠肠黏膜内也可能有少量白细胞浸润，因此以组织学分值大于1作为炎性反应产生的病理学基线。由2位病理科医师分别双盲阅片，结果取均值。

1.2.3.5 血清中细胞因子测定 造模及给药期间每日对动物进行检查和称重。于第10天留取血液，用ELISA试剂盒测定TNF-α、IL-6含量，具体步骤按试剂盒说明书进行操作[11]。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18统计软件处理数据，实验结果以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠的一般情况 空白组小鼠进食、饮水量及活动均正常，无腹泻便血。模型组小鼠与空白组比较，饮食及活动减少，体质量明显下降，出现较严重的稀便及便血症状。共死亡3只。阳性药组及珍珠烫伤膏低、高计量组小鼠与模型组比较，饮食及活动增多，稀便及便血症状有所改善。阳性药组死亡1只，珍珠烫伤膏低、高剂量组各死亡2只。

2.2 小鼠体质量及疾病活动指数（DAI）变化情况  空白组小鼠饮食、活动及排便情况均正常。模型组小鼠在饮入2.5%DSS后，随即出现体质量下降，从第4天开始，体质量下降较为明显，并出现严重便血、腹泻等情况。给予珍珠烫伤膏后，小鼠体质量减轻症状有所改善（P<0.05）。见图2。与空白组比较，模型组DAI评分显著增高（P<0.05）。Pso低、高剂量组分别与模型组比较，DAI评分均显著降低（P<0.05），说明珍珠烫伤膏低、高劑量组对小鼠腹泻、便血及体质量下降等情况均有一定的改善作用。见图3。

2.3 结肠长度变化 模型组小鼠结肠长度明显缩短，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.05）。给予低、高剂量Pso及阳性药物后，结肠长度与模型组比较显著增加（P<0.05）。实验结果表明珍珠烫伤膏对UC引起的小鼠结肠缩短有改善作用。见图4。

2.4 结肠病变评分变化情况 结肠病变评分结果表明，正常组小鼠结肠情况正常，未见明显充血。而模型组小鼠结肠有不同程度的充血，其中部分小鼠结肠出现严重的溃疡，与空白组比较，其病变评分显著增高（P<0.05）。而Pso低、高剂量组动物肠黏膜损伤情况均有所好转（与模型组比较差异有统计学意义，P<0.05）。实验结果表明珍珠烫伤膏对UC引起的小鼠结肠溃疡有改善作用。见图5。

2.5 结肠HE染色结果及病变评分 通过HE染色对结肠炎性反应和溃疡的严重程度进行评估。显微镜下观察结果，正常组（如图6A）小鼠黏膜层肠腺排列紧密，肠腺上皮细胞形态正常（如箭头1），模型组（如图6B）小鼠结肠可见明显溃疡，黏膜层肠腺及上皮完全丧失，并伴有大量炎性细胞浸润（如箭头2），炎性反应侵及黏膜下层及肌层（如箭头3）;各观察组（如图6C-E）小鼠在美沙拉嗪或Pso低、高剂量给药后，炎性细胞浸润减少，肠黏膜上皮细胞完整性有所转归（如箭头4），结肠黏膜损伤有所改善。病变评分如图7所示，与空白组比较，模型组病变评分显著增高（P<0.05）。与模型组比较，Pso低、高剂量组经给药后，病理评分显著降低（P<0.05）。说明珍珠烫伤膏对DSS诱导的UC模型小鼠肠黏膜有一定的修复作用。

2.6 鼠血清中TNF-α、IL-6的含量变化 模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6的含量均显著高于空白对照组（P<0.05）;阳性药组及Pso低、高剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-6的含量与模型组比较均显著降低（P<0.05）。说明珍珠烫伤膏可降低由DSS诱导的UC模型小鼠血清中炎性细胞因子的含量。见图8、9。

3 讨论

溃疡性结肠炎的发病机制尚不明确，一般认为与免疫、遗传和炎性反应因子有关。我国的溃疡性结肠炎患者以中青年为主，病情以轻中度多见[12]。病变部位50%～70%位于直肠及乙状结肠。病变黏膜的表面呈颗粒状、弥漫性充血、水肿、灶性出血，溃疡及糜烂。组织病理检查可见黏膜及黏膜下层有大量的浆细胞、单核细胞及淋巴细胞浸润[13]。治疗药物主要以氨基水杨酸类、糖皮质激素类及免疫制剂类为主[14]。但是，因其不良反应较多和价格昂贵等问题，使得这些药物并不能完全满足临床的需要[15]。因此，有更多的临床医生开始将目光聚焦在我国传统中药方剂上，在中医药的宝库中探寻新的治疗方法。

在中医理论中，溃疡性结肠炎根据其临床表现可归属于“肠癖”“肠风”“泄泻”“休息痢”等范畴[16]，各方医家对于病机的认识虽不甚相同，但都大致可归结为人体先天不足或后天失和，加之外感时邪、饮食不洁（节）或情志内伤等因素，导致体内气机运行不畅、水液代谢失调，湿热内阻大肠而成[17]。中药治疗溃疡性结肠炎应用健脾益气、活血化瘀、清热解毒、燥湿涩肠、止泻等方法，疗效确切，能够明显改善患者腹泻、便血等症状，并且痊愈率高、复发率低[18-20]。其中，中药灌肠治疗溃疡性结肠炎，可使药物直达病灶，修复溃疡面，改善血液循环，降低毛细血管通透性从而抑制渗出，改善炎性反应症状，并且其避免了口服首过效应，增加了生物利用度，逐渐被人们所重视并加以利用[21]。

临床发现采用珍珠烫伤膏灌肠治疗溃疡性结肠炎，可以较好地控制炎性反应症状，促进溃疡愈合，尚未发现明显不良反应。其组成中大黄清热泻火，利湿退黄。黄连、黄柏清热燥湿，其对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等病原微生物有抑制作用。黄芩祛湿热，其黄芩素、黄芩苷等有效成分具有抗炎作用。珍珠粉可解毒生肌。罂粟壳为涩肠止泻常用药，尤适用于久泻久利，和地龙还可活血化瘀，收敛生肌[22]。诸药合用，可清热解毒，去腐生肌，收湿敛疮，符合UC的中医辨证。

实验结果表明，由DSS诱导的UC模型小鼠，在经过珍珠烫伤膏灌肠治疗后，疾病活动指数、结肠病变评分及HE染色病变评分均显著下降，由UC引起的体质量下降及结肠长度缩短均有所改善，同时可以降低血清中炎性细胞因子的含量，说明珍珠烫伤膏对由DSS诱导的UC模型小鼠有一定的治疗作用，能够明显改善其腹泻、便血等症状，降低结肠炎性细胞浸润，保护结肠黏膜。在分子水平上，Pso能够下调DSS诱导的UC小鼠血清中炎性指标IL-6和TNA-α的表达。本实验初步明确了珍珠烫伤膏治疗溃疡性结肠炎的体内药效。

综上所述，通过本实验结果，明确了珍珠烫伤膏治疗UC的药效，为临床经验用药提供了科学依据，但是其治疗UC的分子机制尚不确切，可能与调节结肠黏膜RNA的表达水平、提高SOD活性及降低MDA、MPO等因素有关，故仍须进一步探索研究。

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