隔药饼灸对慢性支气管炎模型大鼠肺组织内p-p38MAPK、ICAM-1的影响

魏星　谭静　言芳　孙希　孙璐　罗明　阳仁达

摘要 目的：观察隔药饼灸对慢性支气管炎大鼠p-p38MAPK、ICAM-1的影响。方法：将48只SD大鼠随机分成空白组、模型组、隔药饼灸组、隔纸垫灸组，每组12只。选用改良烟熏法建立大鼠慢性支气管炎模型，干预后，测定肺泡灌洗液中性粒细胞含量，各组大鼠ICAM-1 mRNA选用RT-PCR术测定、ICAM-1及p-p38MAPK蛋白选用Western blot检测。结果：与空白组比较，模型组中性粒细胞、p-p38MAPK、ICAM-1 mRNA及蛋白含量增高显著（P<0.01）。与模型组比较，隔药饼灸组中性粒细胞数目减少（P<0.05），p-p38MAPK、ICAM-1 mRNA及蛋白含量显著降低（P<0.01）。与隔纸垫灸组比较，隔药饼灸组中性粒细胞、p-p38MAPK蛋白、ICAM-1 mRNA及蛋白降低更明显（P<0.05）。结论：隔药饼灸可通过减少p-p38MAPK蛋白含量、降低ICAM-1 mRNA及其蛋白水平，抑制中性粒细胞的释放，以改善炎性反应环境治疗慢性支气管炎。

关键词 隔药饼灸;慢性支气管炎;中性粒细胞;ICAM-1;p-p38MAPK;大鼠;模型

Effects of Cake-separated Moxibustion on p-p38MAPK and ICAM-1 in Rats′ Lung Tissue with Chronic Bronchitis

Wei Xing，Tan Jing，Yan Fang，Sun Xi，Sun Lu，Luo Ming，Yang Renda

（Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Abstract Objective：To observe the effects of cake-separated moxibustion on intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）and p-p38MAPK in rats with chronic bronchitis. Methods：A total of 48 Sprague-Dawley（SD）rats were randomly separated into the blank group，model group，cake-separated moxibustion group and paper pad-separated moxibustion team（12 in each group）. In addition to the blank group，other 3 groups used modified fumigation to establish the chronic bronchitis models of rats. After intervention，the content of neutrophils in Bronchoalveolar Lavage Fluid（BALF）was measured. ICAM-1 mRNA was detected by RT-PCR，while protein contents of ICAM-1 and p-p38MAPK were detected by Western blot. Results：Compared with the blank group，the contents of neutrophils，p-p38MAPK and ICAM-1 mRNA were obviously increased in the model group（P<0.01）. Compared with the model group，the number of neutrophils was decreased（P<0.05）and the contents of p-p38MAPK，ICAM-1 mRNA were significantly decreased（P<0.01）. Compared with the paper pad-separated moxibustion group，the contents of neutrophils，p-p38MAPK，ICAM-1 mRNA and protein were significantly decreased in the cake-separated moxibustion group（P<0.05）. Conclusion：Cake-separated moxibustion can inhibit the release of neutrophils and significantly reduce the inflammatory reaction，by reducing the contents of p-p38MAPK，ICAM-1 mRNA and protein，so as to treat chronic bronchitis.

Key Words Cake-separated moxibustion; Chronic bronchitis; Neutrophil; ICAM-1; p-p38MAPK; Rat; Model

中圖分类号：R245.8文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.009

慢性支气管炎（Chronic Bronchitis，CB）是以反复发作的咳嗽、咯痰、常伴喘息为主要特点的非特异性炎性病症。近年来，随着环境的变化和不良的生活习惯，CB的发病率在全球范围内持续走高，且易进展成肺气肿、肺心病等疾病，对患者生存生活造成威胁[1-2]。尽管CB的病因复杂，但其病理改变十分明确，即以气道的炎性反应为典型，病变部位常聚集有大量中性粒细胞。这些细胞通过作用于支气管内皮细胞，促进其释放ICAM-1、蛋白酶等物质，这个过程主要受p38MAPK通路调节，激活后能释放系列炎性因子，大量炎性反应因子又能反作用进一步激活上述通路，导致炎性反应瀑布反应[3]。我们前期研究表明：隔药饼灸能显著改善CB大鼠的一般症状，促进血清免疫球蛋白IgA及IgG的表达，纠正T淋巴亚群紊乱，减少肿瘤坏死因子-α等释放，起到治疗慢性支气管的作用[4-5]。然而，隔药饼灸是否对CB大鼠气道内中心粒细胞有影响？上述影响与p-p38MAPK通路有关？为此进行了以下探究。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 48只健康的SD大鼠，雌雄各半，由湖南中医药大学动物实验中心提供（动物合格证编号：SCXK（湘）2017-0003），饲养于湖南中医药大学动物实验中心，温度20 ℃～25 ℃，湿度50%～70%。

1.1.2 药物 所用药饼配方为玉屏风散，按2∶4∶4∶1∶1比例称量防风、炒白术、黄芪、薄荷、冰片（中药购于湖南中医药大学第一附属医院），后两者作为透皮促透剂使用。将中药材混合物磨成细粉，经200目筛后装瓶。实验前，将瓶内粉末用姜汁调成糊状，制成厚度3 mm，直径1 cm的圆饼。艾炷选用“神灸300灸”（东方1型），产于苏州东方艾绒厂。

1.1.3 试剂及仪器

瑞氏染液购于南京建成科技有限公司;兔ICAM-1抗体、p-p38MAPK抗体均购于北京博奥森生物技术有限公司;JY3002型电子天平购自上海精密科学仪器有限公司;切片机购于820HistostAt Reichert公司;摄影生物显微镜购于MOTIC;DG-Ⅲ双稳数显电泳仪购于北京鼎国生物技术发展中心。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

将48只大鼠随机分成空白组、模型组、隔药饼灸组、隔纸垫灸组，每组12只。选取改良烟熏法建立大鼠CB模型[6]。造模时，空白组安置于无烟环境，其他3组置于1 m×1 m×1 m玻璃房内，点燃烟叶、锯末、刨花各50 g，每次烟熏30 min，2次/d，连续1个月。

模型成功评判标准：鼻黏膜色泽紫红，分泌物较多，出现咳嗽、喘息，食欲降低，运动迟缓;病理切片显示支气管管腔分泌物较多，炎性细胞散布，黏膜上皮坏死脱落，杯状细胞增生，气管壁平滑肌增生。

1.2.2 干预方法

隔药饼灸组：Ⅰ组选取肺俞、肾俞;Ⅱ组选取关元、足三里。穴位定位参考《实验针灸学》中图谱[7]。造模结束后，先定位穴位，用剪刀将穴位及其周围直径2 cm的鼠毛剪去，细小的绒毛则采用100 g/L硫化钠对其脱除。将药饼用胶布固定于穴位上，将撕去纸垫的艾炷置于药饼上，点燃艾炷，待其燃尽更换，每穴施灸3壮，约20 min，1次/d，Ⅰ组、Ⅱ组穴位隔日轮流艾灸，持续2周。

空白组、模型组固定捆绑20 min;隔药饼灸组按上述施灸操作进行，施灸20 min;隔紙垫灸组去除纸垫下的胶带，贴附于穴位上，余操作同隔药饼灸组。

1.2.3 检测指标与方法

实验期间观察记录大鼠体质量、精神情况、毛色光泽、口鼻腔分泌物、运动幅度、进食量等。支气管病理切片：取右肺中叶组织放于4%多聚甲醛固定1 d，经脱水、包埋、切片、HE染色后光镜下观察。中性粒细胞数量测定：将肺泡灌洗液4 ℃、4 000 r/min转速离心4 min，弃上清液，20%碘伏溶液染色后，光镜下细胞计数。将剩余的灌洗液再次离心4 min，4 000 r/min，取下部沉渣涂片，风干后，用无水乙醇将其固定5～10 min，瑞氏染色后，光镜观察，划取3个视野，对中性粒细胞和细胞总数进行计数，算出中性粒细胞占细胞总数的平均百分数（%），再根据已算得的细胞总数，计算出中性粒细胞数量。ICAM-1 mRNA及其蛋白的测定：取右肺上叶临近中心气道的肺组织置于1 mL EP管内，在-80 ℃条件下保存，采用RT-PCR法检测ICAM-1 mRNA，Western blot测定ICAM-1蛋白。p-p38MAPK蛋白测定：取右肺下叶临近中心气道的肺组织置于1 mL EP管内，在-80 ℃条件下保存，Western blot来测定p-p38MAPK蛋白。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

空白组大鼠一般情况良好，未见咳嗽、喘息等症状、皮毛光亮、动作灵活、饮食正常;模型组则在造模1周后，出现咳嗽、喘息，随着时间推移，咳嗽喘息程度加重，口鼻腔黏膜呈紫红色，分泌物较多，同时精神不振、皮毛萎黄无光、动作缓慢;隔药饼组大鼠经施灸治疗后，喘息、咳嗽等症状明显减轻，口鼻腔黏膜由紫红逐渐变淡恢复至淡红，口鼻腔分泌物减少，毛发较有光泽，活动增多，动作迅速;隔纸垫灸组大鼠经干预后状态亦趋好转。

2.2 病理形态学观察

空白组无明显病理学变化。见图1、2。模型组纤毛脱落，杯状细胞增生，肺泡壁变薄，气管黏膜下层存在大量炎性细胞。见图3、4。隔药饼灸组气管、肺泡未见明显异常，与模型组比较，纤毛脱落、管腔分泌物、炎性细胞浸润情况明显减轻，纤毛分布较正常，杯状细胞稍有增生，提示经隔药饼灸治疗后，支气管炎性反应环境得到明显控制。见图5、6。隔纸垫灸组纤毛较稀疏，分布稍显紊乱，黏膜结构稍模糊，气管黏膜下层存在少量炎性反应细胞，与模型组比较，隔纸垫灸组支气管炎性反应在逐渐减轻。见图7、8。

2.3 隔药饼灸对大鼠肺泡灌洗液中性粒细胞的影响

治疗前，与空白组比较，模型组肺泡灌洗液中性粒细胞含量增加显著（P<0.01）;治疗后，与模型组比较，隔药饼灸组中性粒细胞含量升高明显（P<0.05）;与纸垫灸组比较，隔药饼灸组肺泡灌洗液中性粒细胞明显降低（P<0.05）。见表1。

2.4 隔药饼灸对大鼠肺组织ICAM-1 mRNA及其蛋白的影响

治疗前，与空白组比较，模型组大鼠ICAM-1 mRNA及其蛋白水平升高显著（P<0.01）;治疗后，与模型组比较，隔药饼灸组大鼠ICAM-1 mRNA及其蛋白含量降低明显（P<0.01）;与隔纸垫灸组比较，隔药饼灸组降低更明显（P<0.05）。见表2。

2.5 隔药饼灸对大鼠肺组织p-p38MAPK蛋白含量的影响

治疗前，与空白组比较，模型组p-p38MAPK蛋白含量升高明显（P<0.05）;治疗后，与模型组比较，隔药饼灸组大鼠p-p38MAPK蛋白含量均显著减少（P<0.01）;与隔纸垫灸组比较，隔藥饼灸组p-p38MAPK蛋白含量明显降低（P<0.05）。见表3。

3 讨论

p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPK）中的重要成员，在细胞生长分化、凋亡、炎性反应、应激等重要生理过程发挥作用，是调控炎性反应的关键通路之一。该通路被MKK 3，4，6激活后生成p-p38[8]，下游IKB激酶被连锁激活，NF-KB活化，调控内皮细胞促进黏附分子ICAM-1、VCAM-1相关基因的转录表达，造成内皮细胞损伤[9-10]。在慢支发展过程中，内皮细胞损伤是其中的关键环节，而细胞粘附因子ICAM-1是介导内皮细胞损伤的重要因素[11-12]。ICAM-1可诱导中性粒细胞与气道上皮细胞的加强黏附，富集中性粒细胞到炎性反应区，分泌释放细胞活性物质，损伤气道上皮细胞，造成支气管肺组织损伤[13-14]。

隔药饼灸属于间接灸、隔物灸，是将中药混合物为主要成分的饼状物置于穴位上，结合药饼上艾炷的温热效应，促进中药有效成分经皮吸收进入穴位，充分发挥温热效应、药物的药化作用和腧穴的相对特异性，有效结合灸—药—穴综合治疗作用，将药物的作用成分最大程度透皮吸收进入体内，达到扶正固本的目的。本研究药饼配方源自玉屏风散，玉屏风散记载于《丹溪心法》，具有益气健脾、固表止汗之功。有研究表明[15]，玉屏风散可有效降低咽部ICAM-1的表达，减少中性粒细胞等炎性细胞的浸润，达到改善炎性反应的目的。实验研究表明[16]，玉屏风散可显著抑制血管细胞粘附分子表达，从而达到减轻呼吸道炎性反应的目的。

本研究中选取了肺俞、足三里、肾俞、关元四穴。其中肺俞、肾俞分别为肺脏、肾脏的背俞穴，是所属脏器的经气聚集地，常用来治疗相应脏腑病证。中医学认为慢支其病位主要在肺肾，“肺为气之主，肾为气之根”，吸入之气需要肺之肃降，同时需要肾之纳气以维持呼吸深度，肺肾相互配合才能保证呼吸正常进行。关元、足三里是强壮要穴，可补益先天之本和后天之本，进而调节免疫，匡正祛邪。研究表明[17-18]，针灸足三里、关元，可降低脑卒中大鼠IL-1β、IL-6等炎性因子，减轻了脑缺血损伤早期炎性反应，并能降低术后感染率。

本研究结果显示：治疗后，与模型组比较，隔药饼灸组、隔纸垫灸组中性粒细胞含量均升高明显（P<0.05）;隔纸垫灸组和隔药饼灸组大鼠p-p38MAPK蛋白含量均下降显著（P<0.01）;隔纸垫灸组大鼠ICAM-1 mRNA及其蛋白含量降低明显（P<0.05），并且隔药饼灸组降低更显著。与隔药饼灸比较，隔纸垫灸组肺泡灌洗液中性粒细胞、p-p38MAPK蛋白含量增高明显（P<0.05）。

由此可见，隔药饼灸是通过下调ICAM-1、p-p38MAPK的表达来抑制中性粒细胞的释放与聚集，从而改善慢支的炎性反应环境，达到治疗慢支的目的。综上所述，隔药饼灸治疗慢支的机制可能在于通过抑制p38MAPK通路的过度激活、减少了ICAM-1、p-p38MAPK分泌，抑制了中性粒细胞的释放，减轻呼吸道炎性反应环境，切断了气道炎性反应链，进而达到治疗CB的作用，但是具体是受p38MAPK通路哪个环节调控及调控机制尚未明确，有待进一步探讨。

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