基于高通量测序鉴定慈姑黄化病病原

张驰 胡成慧 邱静思 苏燕 邹承武

摘要：【目的】明确引致广西平乐县慈姑大面积黄化的主要病原物，为该病害的防治提供参考。【方法】从广西平乐县采集自然表现褪绿黄化症状的慈姑植株，分别提取其叶片和茎组织的总RNA，利用RNA-Seq高通量测序技术对其转录组进行测序，并对序列组装获得的重叠群（contigs）进行BLAST注释，筛选出注释为植原体16S rRNA序列的contigs，根据其序列设计引物Phy-F和Phy-R，以采集的褪绿黄化症状慈姑植株和无症状植株的叶片样本总DNA为模板，进行PCR鉴定。【结果】对扩增获得的长度为1.5 kb的DNA片段进行序列测定，从分子水平证实慈姑黄化病的病原为植原体（strain：AY-China）。将测序获得的植原体16S rRNA序列与GenBank收录的15个植原体分组代表菌株的16S rRNA序列进行比对分析并构建系统发育进化树，发现AY-China与翠菊黄化植原体16SrI组（Aster yellows group：16SrI）聚类在同一分支，且各组代表菌株的16S rRNA序列相似性在88.3%～96.0%。进一步将AY-China与16SrI不同亚组代表菌株的16S rRNA序列进行多重比对并构建系统发育进化树，发现AY-China与翠菊黄化植原体16SrI-B亚组聚类到在一分支，且与16SrI-B亚组代表菌株的16S rRNA序列相似性高达99.5%，说明AY-China应属于16SrI-B亚组。【结论】广西平乐县慈姑黄化病病原为植原体，其隶属于翠菊黄化植原体16SrI-B亚组。

关键词： 慈姑黄化病;高通量测序;植原体;16S rRNA序列;系统进化分析

中图分类号： S436.45;S432.44                 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0578-07

0 引言

【研究意义】慈姑（Sagittaria sagittifolia L.）隶属于泽泻科慈姑属，为多年生水生草本植物，其球茎可食用或制作淀粉，亦可入药（王汉荣等，2009）。近年来，随着慈姑产业的发展，慈姑病害问题不断出现。据报道，目前慈姑病害主要有黑粉病、叶斑病、褐斑病、斑纹病、软腐病、叶柄基腐病、链孢霉红粉病和粘菌病等（陈建明等，2016）。2017年在广西平乐县大面积发生一种慈姑黄化病，喷施多种杀真菌和杀细菌药剂进行防治均无效果，根据其叶片出现黄化和斑驳症状，初步推测其感染病毒或植原体，但目前国内外尚无病毒或植原体引致慈姑植株黄化的报道，无确切的病原物序列信息可供参考。因此，利用新技术对慈姑未知病原物进行鉴定，对于制定有针对性的防治方案具有重要意义。【前人研究进展】测序法是鉴定病原物最准确的方法之一，将植物病害样本的高通量测序数据与现有的微生物基因信息数据库进行比对，可迅速鉴定出各类病原微生物。自2009年高通量测序技术应用于新病毒检测以来，该技术在快速鉴定病原物，特别是未知病原物方面展现出巨大的优势（Saldarelli et al.，2017）。迄今，应用高通量测序技术已成功鉴定了上百种新的植物病毒和类病毒（马宇欣和李世访，2016）。Rosario等（2014）通过粉虱的RNA病毒元基因组测序发现并鉴定了由粉虱传播的香石竹潜隐病毒属病毒（Carlavirus）;Mardi等（2015）對酸橙鬼帚病样本和健康的酸橙样本分别进行高通量转录组测序，在酸橙鬼帚病样本中鉴定到植原体的基因表达，发现2805个差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs），其中上调的DEGs主要富集在细胞壁合成与降解途径、激素生物合成途径、信号转导途径、蔗糖代谢途径、次生物质代谢途径、氨基酸和脂类代谢途径等，而下调的DEGs主要富集在泛素蛋白水解和氧化磷酸化途径;Su等（2015）应用小RNA深度测序技术鉴定了柠檬树上的啤酒花矮化病毒;辛敏（2017）对采自河南省开封市西瓜田呈现典型病毒病症状的样品进行高通量测序，通过序列拼接和比对，鉴定出5种已知的西瓜病毒和3种未知RNA病毒;王慧煜等（2018）利用高通量测序技术对来源于不同边境地区的蜱类进行宏基因组测序，并对其所携带的病原基因序列进行鉴定和分类;Rott等（2018）利用高通量测序技术对苹果软枝病的病原进行鉴定，发现苹果软枝病毒ARWV-1和ARWV-2。【本研究切入点】目前国内外对慈姑病毒和植原体的研究极少，单凭慈姑黄化症状无法确定其病原是病毒还是植原体。由于高通量测序技术用于鉴定病原物可不依赖病原物序列信息，因此本研究拟利用该技术对慈姑黄化病的样品进行高通量测序，以期获得其病原物的序列信息，从而鉴定该病害的病原物。【拟解决的关键问题】利用Illumina HiSeqTM 4000高通量测序平台对慈姑黄化症状样品进行转录组高通量测序，并对组装获得的单基因簇（unigene）进行注释，根据注释信息筛选出病原物信息，以明确引致广西平乐县慈姑大面积黄化的主要病原物，为该病害的防治提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料：自然表现褪绿黄化症状的慈姑植株和无症状慈姑植株均采自广西桂林市平乐县。主要试剂：植物DNA提取试剂盒及胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;2×ES Taq Master Mix（含染料）购自康为世纪生物科技有限公司;琼脂糖BIOWEST® Regular Agarose G-10购自Biowest公司;GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder购自Thermo公司;克隆载体pMD18-T和TRIzol试剂购自宝生物工程（大连）股份有限公司;其他试剂为国产分析纯。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 慈姑黄化病病原体检测 取褪绿黄化症状的慈姑叶片和茎组织各0.1 g，分别用TRIzol法提取总RNA，经质检符合RNA-Seq要求后，将两个样品的总RNA各取1.0 μg混合后进行RNA-Seq建库，利用Illumina HiSeqTM 4000高通量测序平台进行深度测序，然后对去除接头（adapter）和低质量读段（reads）的有效读段（clean reads）进行组装获得unigene，分别将unigene在NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库中进行BLAST注释，再通过分析注释信息筛选疑似病原体的核酸序列信息。根据RNA-Seq测序获得的病原体序列信息设计引物，对自然表现褪绿黄化症状的慈姑样品和无症状慈姑样品进行PCR鉴定。PCR反应体系20 μL：cDNA模板1 μL，2×ES Taq Master Mix 10 μL，10 μmol/L的正、反向引物各1 μL，ddH2O 7 μL。扩增程序：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环;72 ℃延伸5 min;12 ℃保存。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物：取2 μL PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用Syngene G：Box凝胶成像系统（英国Syngene公司）进行拍照。

1. 2. 2 PCR产物亚克隆与序列分析 PCR产物切胶回收后与pMD18-T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后从蓝白筛选培养基上挑取白色的单菌落进行PCR鉴定以获得阳性克隆，再对阳性克隆进行序列测定。使用MEGA 6.0中的ClustalW算法，将测得的慈姑植原体16S rRNA序列与GenBank上下载的15个植原体分组（I～XV）代表菌株的16S rRNA序列进行多重序列比对，去除两端未对齐的序列，使用最大似然法（Maximum likelihood，ML），参数默认，自助值检验1000次，构建系统发育进化树。使用DNASTAR Lasergene v7.1的MegAlign模块进行序列相似性分析。

2 结果与分析

2. 1 慈姑黄化病病株症状表现

感病慈姑植株叶片自顶端和边缘开始表现黄化症状，首先是叶缘和叶脉发黄，然后叶脉间的叶肉逐渐黄化，严重时整株黄化枯死。

2. 2 高通量测序分析结果

利用Illumina HiSeqTM 4000高通量测序平台对采集的慈姑黄化病样品进行转录组高通量测序，并对组装获得的unigene进行基因功能注释，然后对所有注释的unigene数目进行统计。结果发现，有59.66%（62696条）的unigene得到注释。对注释信息进行筛选，发现存在8条丰度较高的植原体基因序列，其中植原体16S rRNA序列的覆盖度最高（76.22倍），未发现病毒序列信息（表1）。

2. 3 PCR鉴定及序列分析结果

根据获得的植原体16S rRNA序列信息设计并合成引物（Phy-F： 5'-CCCAATACGAAGAGTTTGAT CCT-3'和Phy-R： 5'-GGATACCTTGTTACGACTTAAC C-3'，预期PCR产物大小为1504 bp），经PCR检测发现植原体检测引物在所采集的慈姑黄化病DNA样品中均能扩增出与预期结果相符的特异性目的片段，而在无症状样品中未扩增出目的片段。对扩增获得的特异性目的片段进行克隆及序列测定，序列相似性分析结果表明，该株系与植原体16SrI组中各植原体的核苷酸序列相似性均在98.6%以上，其中与翠菊黄化植原体16SrI-B亚组（Aster yellows subgroup，16SrI-B 亚组）的小茴香黄化植原体DfY-1菌株（GenBank登录号DQ381534）的核苷酸序列相似性最高，达99.5%;与其他16Sr组的核苷酸序列相似性在88.3%～96.0% （表2）。因此，黄化慈姑植株中存在的植原体属于翠菊黄化植原体16SrI-B亚组。将此植原体暂命名为慈姑黄化植原体中国分离物（Strain：AY-China;GenBank Accession No. MH428835.1）。

2. 4 慈姑黄化植原体16S rRNA序列系统进化地位分析结果

根据AY-China和GenBank中15个植原体分组代表菌株的16S rRNA序列相似性构建系统发育进化树，发现16个分离物形成两大分支，其中16SrV、16SrVI、16SrVII、16SrVIII、16SrIV、16SrIX、16SrXI、16SrXIV、16SrIII、16SrII和16SrXV組的分离物聚到一起，而16SrX、16SrXIII、16SrXII、16SrI和Arrowhead yellows形成另一分支。再选取16SrI中各亚组的代表菌株与AY-China构建系统发育进化树，结果发现AY-China与小茴香黄化植原体（Dogfennel yellows，DfY-1菌株）的关系最近，且二者的16S rRNA序列相似性达99.5%，说明AY-China属于16SrI-B亚组。

3 讨论

3. 1 应用高通量测序鉴定未知病原物的优势

传统的病原鉴定主要通过病害典型症状对其可能的病原物种类进行初步鉴定，再结合生物学接种、血清学、电镜或PCR等技术进行进一步鉴定。高通量测序技术的出现为病原物检测提供了新途径，将高通量测序结果与微生物基因信息数据库进行比对，不仅可迅速鉴定出各类病原微生物，还能通过未知序列鉴定新的物种（潘嵩等，2014）。利用该技术可一次性检测获得样品中可能感染的多种病原物信息，特别适合于鉴定多种不同病原物混合侵染的样品。目前，该技术在动植物病原微生物鉴定中已得到广泛应用（李洋和苏晓红，2016;马宇欣和李世访，2016;曹毅等，2017）。此外，高通量测序技术相对于第一代Sanger测序技术具有通量高、单碱基测序成本低和灵敏度高等优势。同时，深度测序可检测复杂样品中非常低丰度的成员，极大提高复合样品中检疫性病原物的检出率（潘嵩等，2014）。

3. 2 慈姑黄化植原体的防治建议

目前植原体分类体系主要分为15个组和若干个亚组，并且已公布23种植原体的基因组全序列，包括玉米丛矮植原体（Maize bushy stunt phytoplasma）（Bedendo et al.，1997）、翠菊黄化植原体（Aster yellows phytoplasma）（Bai et al.，2006）、苹果丛生植原体（Candidatus Phytoplasma mali）（Kube et al.，2008）、洋葱黄化植原体（Onion yellows phytoplasma）（Ishii et al.，2009）、芸香植原体（‘Brassica napus’ Phytoplasma）（Petrzik et al.，2011）、澳大利亚植原体候选种（Candidatus Phytoplasma australiense）（Andersen et al.，2013）、花生丛枝病植原体（Peanut witches’-broom phytoplasma）（Chung et al.，2013）和小麦蓝矮植原体（Wheat blue dwarf phytoplasma）（Chen et al.，2014）等。由于国际间的种苗调运和农产品贸易等增加了植原体传播的风险，该病害对农林业生产造成的损失日益加重，在我国已有14种植原体被列为入境检疫性有害生物（牟海青等，2011）。植原体主要定殖于植物韧皮部筛管细胞中，可通过叶蝉、飞虱、木虱、蝽和蚜虫等刺吸式口器昆虫传播，引起多种重要作物病害（牟海青等，2011;王真辉等，2013;杨毅等，2014;魏振等，2018）。因此，根据植原体病害主要依靠昆虫介体等途径传播这一特性，可通过阻断传播途径进行防治。此外，植原体是柔膜菌纲病原体，无细胞壁，只有3层膜包被，对青霉素等一般杀细菌抗生素不敏感，目前主要使用四环素类抗生素（金霉素、土霉素和脱甲基氯四环素）及IBA等生长素类物质进行防治，效果较明显（刘仲健和罗焕亮，1999）。再者，慈姑主要采用球茎或顶芽进行无性繁殖，一旦感染植原体就会代代相传。因此，预防慈姑黄化病应采用种植健康种苗和防虫治虫的大田综合防治方案。

3. 3 慈姑黄化植原体的传播介体

筛选确定传播植原体的介体昆虫有利于其病害的综合防控和治理。本研究在进行田间病害调查时发现有黄化症状的慈姑假茎上出现大量蚜虫，推测蚜虫是传播该病害的介体昆虫。目前对于蚜虫是否能传播植原体仍存在很大争议（王真辉等，2013），因为通过检测昆虫体内是否含有植原体DNA不能作为判断昆虫为植原体传播介体的依据，必须确定植原体能克服昆虫肠道和唾液腺的障碍，定殖并随昆虫的取食而将植原体传播到寄主植物上，才能确认该昆虫为介体（卢恒宇，2016）。此外，侵染慈姑导致黄化病的植原体是否具有遗传多样性以及是否存在其他传播介体，均需要进一步探究。

4 结论

本研究在利用转录组高通量测序技术获取病原物序列信息的基础上设计引物，通过PCR和克隆测序快速鉴定引起慈姑黄化病的病原为慈姑黄化植原体中国分离物（Strain：AY-China;GenBank Accession No. MH428835.1），经与GenBank收录的15个分组植原体代表种构建系统发育进化树，明确慈姑植原体AY-China的分类地位为翠菊黄化植原体16SrI-B亚组。

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（責任编辑 麻小燕）