南方水稻黑条矮缩病对水稻营养物质和两种稻飞虱解毒酶活性的影响

杨熙彬 蒋德春 杨洪 金道超 周操

摘 要：在稻田生态系统中，白背飞虱和褐飞虱常常混合发生。为了探明南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）对水稻主要营养物质和两种稻飞虱体内解毒酶活性的影响，在室内测定了水稻感染SRBSDV后的主要营养物质可溶性糖、游离氨基酸的变化，以及褐飞虱和白背飞虱取食感病稻株后体内乙酰胆碱酯酶（AchE）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活性的变化。结果表明：水稻在感染SRBSDV后，体内可溶性糖含量显著降低，游离氨基酸含量显著升高;在带毒水稻上取食24 h时，白背飞虱和褐飞虱的若虫、成虫体内AchE活性与对照相比显著降低;另外，取食12 h、24 h、5 d时，褐飞虱若虫、成虫体内GST活性显著高于对照，而取食12 h、24 h时的白背飞虱成虫、若虫体内GST活性相比对照稍有增强但差异不显著，但5 d时的酶活性显著高于对照。上述结果表明SRBSDV感染影响水稻体内游离氨基酸和可溶性糖的含量;另外，褐飞虱和白背飞虱取食感病植株后，可通过调节自身解毒酶活性的变化来适应逆境。

关键词：南方水稻黑条矮缩病毒;可溶性糖;游离氨基酸;解毒酶;稻飞虱

中图分类号：

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2019）03-00-0 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.03.001

Abstract：The white-backed planthopper （WBPH） and brown planthopper （BPH） often occur in rice field ecosystems. In order to investigate the effect of southern rice black-streaked dwarf virus （SRBSDV） on the main nutrientsin rice plant and the detoxification enzymes activity of two rice planthoppers，we measured the changes of the main nutrients such as soluble sugar and free amino acid in rice infected with SRBSDV，as well as the changes of Acetylcholinesterase （AChE） and glutathione S-transferase （GST） activities in BPH and WBPH after feeding on infected rice. The results showed that the soluble sugar significantly decreased and free amino acid significantly increased after rice infected SRBSDV. The activities of AchE in nymphs and adults of both WBPH and BPH after feeding for 24 h on infected rice were significantly lower than that of the control groups. In addition，the activities of GST in nymphs and adults of BPH after feeding for 12 h，24 h and 5 d on infected rice were significantly lower than that of the control groups. However，the activities of GST in adults and nymphs of WBPH after feeding for 12 h and 24 h were slightly but not significantly enhanced compared with that of the control groups，while the GTS activity at 5d was significantly higher than that of the control group. The above results demonstrated that SRBSDV infection affected the content of free amino acid and soluble sugar in rice plant. In addition，BPH and WBPH can adapt to adversity by adjusting the activity of detoxification enzymes after feeding on infected plants.

Key words：Southern rice black-streaked dwarf virus; soluble sugar; free amino acid; detoxification enzyme; rice planthoppers

南方水稻黑條矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）隶属于呼肠孤病毒科（Reovirudae）斐济病毒属（Fijiuirus），主要是通过介体昆虫白背飞虱Sogatella furcifera （Horváth）携带传播[1]。SRBSDV于2001年首次在我国广东省阳西县发现，随后的短短几年里此病害快速扩散至我国南部稻区及越南中北部，造成水稻大量减产甚至颗粒无收[2]。

植食性昆虫的生长发育与植株营养物质的含量变化密切相关。已有研究表明，病原物的侵染，会诱导寄主植物的次生化学物质的合成、碳水化合物及氨基酸含量的变化，其中氨基酸含量的改变对韧皮部取食的植食性昆虫影响较大[3-5]。例如Colvin等[6]发现感染东非木薯花叶病（African cassava mosaic virus，ACMV）的植株韧皮部汁液中氨基酸含量显著高于健康植株，且病株上烟粉虱Bemisia tabaci （Gennadius）的生长发育较健康植株的快。何晓婵等[7]研究发现，水稻植株感染水稻黑条矮缩病（rice black streak dwarf virus，RBSDV）后其体内的氨基酸和可溶性糖含量均显著提高，取食该植株的白背飞虱生态适应性均提高。因此，取食感染病毒的植食性昆虫生态适应性的变化与稻株体内游离氨基酸和可溶性糖含量的变化密切相关。

植食性昆虫在选择利用寄主植物的过程中，不可避免会遇到对其生长发育产生不利影响的植物次生代谢物质，导致害虫的代谢活动发生变化，诱发一系列的防御反应[8]。昆虫体内有多种重要的解毒酶系，包括羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）、 谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferases，GST）和乙酰胆碱脂酶（acetylcholinesterase，AchE）等，会通过改变体内解毒酶来应对植物的诱导反应[9]。何晓婵等[7]研究表明，取食感染RBSDV的水稻后，白背飞虱雌性成虫体内解毒酶（AchE、GST和CarE）活性均显著增加。Xu等[10]研究表明，褐飞虱Nilaparvata lugens（Stal）取食感染SRBSDV的病株1代后，成虫体内解毒酶GST和CarE活性分别比取食健康稻株褐飞虱提高了11.77%和47.07%。

稻飞虱是通过刺吸稻株汁液和产卵等对水稻植株造成危害，因此，水稻营养物质的变化直接影响其生长和发育，进而诱导害虫体内生理生化的改变。本文通过比较感染植物病毒SRBSDV的水稻与健康稻株，研究稻株体内可溶性糖和游离氨基酸含量以及稻飞虱成虫、若虫取食水稻后其体内解毒酶活性的变化，明确稻飞虱与寄主间相互作用机制，以期为综合防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻：SRBSDV感染水稻采自贵州省锦屏县新化乡2012年7月发病田块，移栽定植于防虫温室内，对采回的样品参照周倩等[11]方法进行检测后确定为带毒苗。采用室内感染SRBSDV的中优 849 水稻和选取健康的中优849水稻，待长至四叶一心期时取其新鲜叶片作为供试材料。

供试虫源：褐飞虱和白背飞虱分别于 2012 年 6 月和 7 月采自贵州省贵阳市花溪区的稻田，在温度（26±1）℃、湿度（70±1）%、光照 L∶D（16h∶8h）的室内防虫笼里，以无毒TN1水稻饲养3代以上。

1.2 待测虫源

将饲养于无毒水稻TN1上的褐飞虱和白背飞虱3龄若虫或初羽化成虫分别转接于带有SRBSDV的四叶一心期中优849水稻和同龄健康水稻上，每株10头。接虫后12 h、24 h 和5 d取出试虫，用液氮迅速冷冻后转至-80℃冰箱保存备用。

1.3 实验步骤

1.3.1 水稻感染SRBSDV病毒的检测

取室内接毒后长至四叶一心期疑似感染SRBSDV的水稻幼嫩新鲜组织立即检测。提取总RNA，取冷藏的幼嫩叶组织100 mg，加液氮于研钵中研磨成粉末，加入1 mL Trizol，混匀后转入1.5 mL离心管中，加入 200 μL 氯仿，振荡混匀，室温放置15 min。4℃ 12000 g 离心15 min，取上层水相至另一离心管，加入0.5 mL异丙醇，混匀，室温放置10 min，4℃ 12000 g 离心 10 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃ 12000 g 离心5 min，尽量弃上清液。室温干燥5～10 min加入50 μL 0.1% DEPC处理的ddH2O，-80℃保存备用。选用周倩等[11]设计的特异引物：

1.3.2 可溶性糖测定

参照李合生[12]的方法，采用蒽酮比色法测定。

1.3.3 游离氨基酸含量的测定

参照李合生[12]的方法，采用水合茚三酮法测定。

1.3.4 SRBSDV对两种稻飞虱解毒酶活性的测定

酶液的制备：采用1.2方法处理试虫，分别取10头，加入900 μL的生理盐水，用玻璃匀浆器置冰上匀浆，4℃条件下3000 r/min离心10 min，取上清液为酶原液。每个处理重复4次。

牛血清蛋白标准曲线的制备：参照Bradford记述的考马斯亮蓝G-250染色法测定[13]。按表1加入试劑和进行处理：

2 结果与分析

2.1 水稻感染SRBSDV病毒的检测

利用特异性引物对S10F/S10R，采用RT-PCR技术可特异性扩增出室内疑似感染SRBSDV病毒的稻株，得到约477 bp的目的条带，与预期大小相符合，且未出现非特异性条带（图1）。因此，在进行南方水稻黑条矮缩病毒对寄主植物水稻主要营养物质影响测定时，取室内确定感染上SRBSDV的四叶一心期水稻进行备用。

2.2 SRBSDV对寄主水稻可溶性糖和游离氨基酸含量的影响

南方水稻黑条矮缩病毒对寄主水稻可溶性糖和游离氨基酸含量的影响，统计分析结果见表3。感染SRBSDV的水稻叶片和健康水稻叶片内可溶性糖含量分别为2.6317%和 5.8600%，差异显著，且健康水稻叶片内的可溶性糖含量是携带SRBSDV水稻叶片内可溶性糖含量的2.2267倍;感染SRBSDV 的水稻叶片和健康水稻叶片其体内游离氨基酸含量分别为959.2137 μg/g和463.8390 μg/g，差异显著，且携带SRBSDV水稻叶片体内游离氨基酸含量是健康水稻叶片体内游离氨基酸含量的2.0680倍。

2.3 感染SRBSDV对褐飞虱解毒酶活性的影响

2.3.1 SRBSDV对褐飞虱若虫解毒酶活性的影响

褐飞虱在感病水稻和健康水稻上取食不同时间后，体内AchE活性的结果见表4。结果显示，褐飞虱从TN1水稻转至感病的中优849水稻和健康的中优 849 水稻后，若虫取食感病稻株12 h的AchE活性与对照相差不明显，24 h、5 d时的AchE活性显著低于对照，为1.28和1.26倍，随着取食时间延长，在5 d时有上升的趋势;若虫取食感病稻株12 h、24 h、5 d 时的GST酶活性显著高于对照，且24 h时若虫GST活性显著高于对照，为1.48倍，5 d时的活性稍有下调。

2.3.2 SRBSDV对褐飞虱成虫解毒酶活性的影响

褐飞虱在感病水稻和健康水稻上取食不同时间后，体内解毒酶活性的结果见表5。结果显示，褐飞虱从TN1水稻转至感病的中优849水稻和健康的中优849水稻后，成蟲体内AchE活性随取食的时间延长而降低，取食感病稻株12 h、5 d时的AchE活性与对照差异不显著，取食感病稻株24 h时的酶活性显著低于对照，为对照的1.43倍;成虫取食感病稻株12 h、24 h、5 d时的GST酶活性显著高于对照，为对照的1.74、1.77和1.92倍。

2.4 感染SRBSDV对白背飞虱解毒酶活性的影响

2.4.1 SRBSDV对白背飞虱若虫解毒酶活性的影响

白背飞虱在感病水稻和健康水稻上取食不同时间后，体内AchE活性的结果见表6。结果显示，白背飞虱从TN1水稻转至感病的中优849水稻和健康的中优 849水稻后，若虫取食感病稻株12 h、24 h、5 d时AchE活性显著低于对照水平，分别为对照的1.26、1.42和1.59倍;若虫取食感病稻株12 h、24 h、5 d时的GST活性显著高于对照，分别为对照的1.09、1.37和1.34倍。

2.4.2 SRBSDV对白背飞虱成虫解毒酶活性的影响

白背飞虱在感病水稻和健康水稻上取食不同时间后，体内GST活性的结果见表7。结果显示，白背飞虱从TN1水稻转至感病的中优849水稻和健康的中优849水稻后，成虫取食感病稻株12 h时的AchE活性与对照无明显差异，取食24 h、5 d 时的AchE活性显著低于对照，分别为对照的1.42和1.58倍，且成虫取食感病稻株时的AchE活性随取食时间的延长而降低;总体上虫体内GST的活性随取食的时间延长而增高，成虫取食感病稻株12 h、24 h、5 d的酶活性相比对照稍有增强，但差异不显著。

3 结论与讨论

糖类和氨基酸是植物体内的主要营养物质之一，也是昆虫重要营养物质的来源。当病原物侵染植物时，植物的正常代谢过程会受到一定的影响，进而影响到植物体内糖和氨基酸含量。本研究中发现，当SRBSDV侵染水稻后，水稻叶片体内的可溶性糖含量降低，与对照组存在显著差异。闫慧娟等[15]的研究发现感病品种的三叶期玉米植株接种矮花叶病毒（Maize dwarf mosaic virus，MDMV）后，叶片可溶性糖含量下降;张正坤等[16]和毛健民等[17]的研究发现烟草叶片接种烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）后，随着时间的增加，烟草中可溶性糖的含量逐渐下降，与本研究结果基本一致。但何晓婵等[7]的研究发现，水稻在感染RBSDV后植株体内的可溶性糖的含量则是正常稻株的3倍，与本研究试验结果不一致。我们发现，何晓婵等[7]测定的水稻品种为嘉优8号的叶鞘部位，而本实验中测定的是水稻中优849号的叶片部位，因此，我们推测可能是因为不同的水稻品种和测定不同部位造成结果差异。本研究中发现，当SRBSDV侵染水稻后，水稻叶片体内游离氨基酸含量上升，是对照组的2.0680倍，两组之间有显著差异。何晓婵等[7]的研究发现，水稻在感染RBSDV后植株体内的游离氨基酸含量增加31.1%，与本研究结果基本一致。这些研究表明，病毒感染寄主植物后，会影响寄主植物体内营养物质的改变。但这些营养物质的改变，是否有利于媒介昆虫的生长发育，进而有助于病毒的传播，还需要进一步的研究。

昆虫解毒酶及解毒机制在昆虫对植物次生物质的代谢及适应中发挥了重要作用[18]。有研究表明，GST和AchE作为昆虫体内重要的解毒酶，在昆虫的解毒代谢过程中起到重要作用[19-20]。Xu等[10]报道褐飞虱取食感染RBSDV的病株1代后，成虫体内解毒酶GST和CarE活性分别比取食健康稻株褐飞虱提高了11.77%和47.07%，且取食带毒水稻后褐飞虱若虫存活率、雄性若虫发育历期、雌性成虫重量以及孵化率均高于健康水稻上饲喂的飞虱。在本研究中，褐飞虱的成虫、若虫取食感染SRBSDV水稻后，体内AchE活性与对照相比显著降低，并且随着时间的延长，AchE活性整体呈现出降低的趋势;成虫、若虫取食感病稻株12 h、24 h、5 d，体内GST酶活性显著高于对照，这与Xu等[10]的GST活性上升的结果一致。在本实验室前期研究中发现褐飞虱取食感染SRBSDV的水稻后净生殖率、平均世代历期、内禀增长率和周限增长率减小，种群加倍时间稍有增加，表明SRBSDV对非介体褐飞虱的生长发育和繁殖有一定的抑制作用[21]。这与Xu等[10]实验结果不一致，我们推测可能是不同病毒对于害虫的生长发育具有不同的影响。

本研究发现，介体白背飞虱成虫、若虫取食感染SRBSDV水稻后，体内AchE活性显著下降，GST酶活性显著上升。Xu等[22]研究表明，介体白背飞虱在感染SRBSDV的稻株上取食后，若虫发育历期、产卵量与对照相对显著提高，但成虫寿命及孵化率无显著影响。已有研究表明，南方水稻矮缩病毒（SRBSDV）感染的水稻能提高其寄主昆虫白背飞虱的寄主适合度，使其成虫寿命缩短、繁殖力较对照略高、长翅型比例以及蜜露分泌增加[23]。因此，我们能够初步确定白背飞虱体内解毒酶活性的变化从生理生化角度部分解释了其寄主适应性的提高。就取食感病寄主相同时间的测定结果而言，携带SRBSDV的水稻对白背飞虱解毒酶系统的影响大于褐飞虱解毒酶系统的影响。

本研究结果表明，SRBSDV侵染水稻后，水稻叶片体内的可溶性糖含量显著降低，游离氨基酸含量显著上升;褐飞虱和白背飞虱的体内解毒酶GST含量显著上升、AchE含量显著下降，说明稻飞虱在取食感SRBSDV稻株后，导致害虫代谢活动发生变化的原因是通过调节自身解毒酶活性的变化来适应逆境。

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