DNA polβ基因对乳癌细胞MCF-7增殖及侵袭影响

任潇毅 陈建中 刘景超 郑英斌

[摘要] 目的 探究RNA干扰技术沉默DNA聚合酶β（DNA polβ）基因对人乳癌细胞的增殖、侵袭的影响。

方法

构建3种DNA polβ-siRNA质粒，转染人乳癌细胞（MCF-7），选择最优DNA polβ-siRNA质粒进行后续实验。应用荧光定量PCR和Western blot检测质粒转染效率;噻唑蓝（MTT）方法检测DNA polβ-siRNA对细胞增殖能力的影响;Transwell检测敲降DNA polβ基因对MCF-7细胞侵袭能力的影响。

结果 DNA polβ-siRNA不仅能够抑制MCF-7细胞中DNA polβ的表达，而且还能抑制MCF-7细胞的增殖（F=5.8、8.6，P<0.05）和侵袭能力（F=5.2，P<0.05）。

结论 DNA polβ-siRNA可有效抑制MCF-7细胞的增殖和侵袭。

[关键词] 乳房肿瘤;DNA聚合酶β;RNA干扰;MCF-7细胞;细胞增殖;肿瘤转移

[中图分类号] R737.9;R394.114

[文献标志码] A

[文章编号]  2096-5532（2019）06-0696-04

doi：10.11712/jms201906016

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

EFFECTS OF THE DNA POLβ GENE ON PROLIFERATION AND INVASION OF BREAST CANCER MCF-7 CELLS

REN Xiaoyi， CHEN Jianzhong， LIU Jingchao， ZHENG Yingbin

（Department of Breast Surgery， the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450014， China）

[ABSTRACT] Objective To explore the effects of silencing the DNA polymerase β （polβ） gene by RNA interference technology on the proliferation and invasion of human breast cancer cells.

Methods Three DNA polβ-siRNA plasmids were constructed and then transfected into human breast cancer MCF-7 cells. The optimal DNA polβ-siRNA plasmid was selected for subsequent experiments. The efficiency of plasmid transfection was determined by real-time PCR and Western blot. The effect of the DNA polβ-siRNA on cell proliferation was measured by MTT assay. The effect of knockdown of the DNA polβ gene on cell invasion was measured by Transwell assay.

Results The DNA polβ-siRNA significantly inhibited the expression of DNA polβ in MCF-7 cells. Furthermore， the DNA polβ-siRNA significantly inhibited the proliferation （F=5.8，8.6;P<0.05） and invasion （F=5.2，P<0.05） of MCF-7 cells.

Conclusion The DNA polβ-siRNA can effectively inhibit the proliferation and invasion of MCF-7 cells.

[KEY WORDS] breast neoplasms; DNA polymerase beta; RNA interference; MCF-7 cells; cell proliferation; neoplasm metastasis

全球女性中乳癌的发病率和死亡率占女性恶性肿瘤之首[1]。目前，治疗乳癌的主要方法包括手术治疗、放疗和化疗等，但有侵入性强、副作用明显等缺点，对病人身体和心理上有一定程度的损伤[2-4]。因此，寻找新的治疗手段非常重要。DNA聚合酶β（DNA pol β）基因已被证实与多种肿瘤的发生、发展有密切的关系[5-6]。在正常情况下，DNA polβ的表达保持着持续的低水平，而在肿瘤细胞中高表达，并常伴随着结构突变[7]。然而，DNA polβ基因在乳癌细胞中作用研究则少报道。在本文中，我们研究DNA polβ基因对乳癌细胞的增殖和侵袭的影响，探究其是否可作为治疗乳癌的新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳癌细胞MCF-7购买于中桥新舟;转染试剂脂质体2000购自Invitrogen公司;总RNA提取试剂盒购于北京百泰克生物技术有限公司;反转录试剂Quantscript RT Kit与荧光定量试剂SuperReal、荧光定量预混试剂彩色版（SYBR Green）购于天根生化科技（北京）有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术有限公司;抗DNA polβ和β-actin抗体购于Santa Cruz生物公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）购于碧云天生物技术有限公司;脂质体2000购于Invitrogen公司;噻唑藍（MTT）与二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma公司;Matrigel胶购于BD公司。本实验中所用引

物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物序列为CCGCAGGAGACTCTCAACG，下游引物序列为GTACTTGTGGATAGCTTGGCTC。

1.2 方法

1.2.1 质粒构建与转染 构建3种Pslience 2.0-DNA polβ siRNA质粒和1种Pslience 2.0-NC-siRNA对照质粒。以不加质粒的MCF-7细胞为阴性Control组（C组）、以NC-siRNA为对照质粒组（D组）、以1～3号DNA polβ-siRNA质粒为敲降组（E组、F组、G组），筛选DNA polβ-siRNA的敲降效率。培养MCF-7细胞融合达到85%左右，将细胞消化后接种于6孔板中。利用脂质体2000将对照质粒、DNA polβ质粒分别转染进入MCF-7细胞，37 ℃恒温培养24 h后检测转染效率。选择敲降效率最好的siRNA质粒进行后续实验，分组为Control组（A组）、NC-siRNA组（B组）和DNA polβ-siRNA组（C组）。

1.2.2 荧光定量PCR（RT-PCR） 收集细胞，以总RNA提取试剂盒提取总RNA，使用反转录试剂盒反转录总RNA得到样品cDNA。RT-PCR实验检测各组细胞中DNA polβ基因的表达水平。本实验采用20 μL反应体系：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR GREEN master mix 10 μL，ddH2O补齐至20 μL。实验重复3次，结果分析采用2-△△CT方法[8]。

1.2.3 蛋白质印迹（Western blot）实验 RIPA裂解液裂解细胞后，以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。同质量蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将蛋白转印至PVDF膜上，50 g/L脱脂牛奶孵育PVDF膜1 h。利用DNA polβ抗体和β-actin抗体分别孵育PVDF膜，4 ℃过夜。一抗孵育后，使用辣根過氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）作为二抗，孵育PVDF膜（37 ℃、45 min）。二抗孵育后，使用ECL发光液处理，并在暗室中拍照。β-actin作为内参照。

1.2.4 MTT检测 MCF-7细胞转染质粒后培养48 h，加入浓度为5 g/L的MTT溶液，放置于37 ℃恒温培养箱继续培养4 h。取出细胞，吸除上清，向细胞中加入200 μL的DMSO溶液。利用酶标仪测定各组细胞在490 nm波长处的吸光度（A）值，并进行数据分析。

1.2.5 Transwell实验 用Matrigel胶包被Transwell小室，放置于37 ℃培养箱中2 h。将Transwell小室放置于24孔板上，下室加入含体积分数0.30胎牛血清的培养液800 μL，上室加入200 μL、2.5 g/L胰蛋白酶消化后的单细胞悬液，细胞数均为每孔1×104个。将24孔板置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养24 h。培养后，Transwell小室使用40 g/L多聚甲醛室温下固定20 min，5 g/L甲紫染液染色5 min。使用倒置光学显微镜（200倍）对迁移微孔膜下层的细胞进行计数。

1.3 统计学方法

本实验数据统计分析和作图均使用SPSS 13.0软件。计量资料数据用±s表示，组间比较采用单因素方差分析中Bonferroni方法进行数据分析。以P<0.05为差异具有显著性。

2 结 果

2.1 DNA polβ-siRNA敲降效率

本实验利用RT-PCR和Western blot技术检测DNA polβ-siRNA的敲降效率，结果表明，3种DNA polβ-siRNA转染MCF-7细胞后，DNA polβ的mRNA和蛋白水平均明显低于转染NC-siRNA组（F=8.6，P< 0.05）。见图1。在敲降MCF-7细胞中以DNA polβ-siRNA-2质粒的效率最高，采用其进行后续实验。

2.2 DNA polβ-siRNA对细胞增殖影响

MTT检测结果表明，MCF-7细胞转染DNApolβ-siRNA质粒后， DNA polβ-siRNA转染组细胞增殖明显低于NC-siRNA转染组，两组比较差异具有显著性（F=5.8， P< 0.05）。见图2。

2.3 DNA polβ-siRNA对细胞侵袭影响

Transwell实验的检测结果显示，乳癌MCF-7细胞DNA polβ敲降后，DNA polβ-siRNA转染组细胞的侵袭能力明显低于NC-siRNA转染组，两组相比较差异具有统计学意义（F=5.2，P< 0.05）。见图3。

3 讨 论

乳癌在多个国家中是女性发病率最高的恶性肿瘤，严重影响女性的身心健康，受到广泛关注[9-11]。随着分子技术的不断发展，利用基因治疗手段治疗乳癌受到广泛关注，其具有更精准、快速且无副作用的优势[12-14]。

DNA polβ是DNA聚合酶家族中的重要成员，在DNA碱基切除修复中起到重要作用[15]，该酶与肿瘤的形成密切相关[16-19]。DNA polβ基因已被证实与食管癌[20-21]、胃癌[22-23]、眼睑基底细胞癌[24]、宫颈癌[25]、乳癌[26-27]等多种癌症的发生具有密切关系。研究结果表明，DNA polβ基因在乳癌组织中的表达明显高于癌旁组织，在正常的人乳腺上皮细胞MCF-10A中DNA polβ基因的表达也明显低于人乳癌上皮细胞株MCF-7[28-29]，提示DNA polβ基因的表达上调，有可能是导致乳癌恶性增生的机制之一[30]。因此，有效干预DNA polβ过表达，可能对于乳癌的有效防治具有重要理论和实用意义。

本研究采用RNA干擾技术抑制MCF-7细胞中的DNA polβ的表达。结果显示，在抑制DNA polβ的表达后，MCF-7细胞的增殖和侵袭能力均受到显著抑制，与文献报道结果相一致。说明DNA polβ可能是参与乳癌发展过程中重要的因素之一。

综上所述，DNA polβ基因有可能作为治疗乳癌的关键基因靶点，本文结果为乳癌临床治疗的选择提供新的理论依据。但是本文具有一定的局限性，DNA polβ在治疗乳癌中的应用还需要更多的理论研究与临床试验证明。

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