UPLC-DAD法同时测定不同干燥工艺三白草中5种黄酮成分的含量

孙冬梅，段福先，江洁怡,廖小芳，香志豪，李素梅

(1.广东省中医药工程技术研究院(广东省中医药研究开发重点研究室)，广东 广州 510095; 2.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州 520405)

三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.是传统中药，最早记录于《本草经集注》，分布于河北、河南、山东和长江流域及其以南各地，生于低湿沟边、塘边或溪旁[1]。研究报道，三白草药材含有挥发油、黄酮、木脂素、生物碱、鞣质等成分[2]，并具有广泛的药理作用。三白草中黄酮类化合物具有很好的抗氧化作用[3]，其中的芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷和槲皮素具有多种生物活性[4]。通过对三白草的地上部分进行活性检测，发现其中3个黄酮醇化合物具清除自由基的活性[5]；芦丁具有清除自由基、促进成骨细胞的生长、降低血糖、抑制结肠癌和前列腺癌等作用[6]；金丝桃苷具有明显的抗感染作用[6]；槲皮素和槲皮苷具有抑制葡萄糖和半乳糖还原成相应的多元醇的作用，在阻止由糖尿病引起的白内障、神经病和血管类疾病的发生发挥重要作用[7]。

越来越多的研究报道，干燥加工过程不仅是促使药用部位所含水分减失至有利于运输、贮藏，更为重要的是干燥过程，也是中药材及中药饮片药性形成的重要环节[8-10]。本文研究了烘箱30 ℃干燥、烘箱60 ℃干燥、真空冷冻干燥3种干燥工艺对三白草中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素等5种成分质量分数的影响，为改进三白草的初加工及三白草的开发利用提供理论基础。

1 仪器与材料

Agilent 1290超高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器(美国)；KQ-700DE数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；TLE204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；HH-6恒温水浴锅(北京精科华瑞有限公司)；CIENTZ-30F冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司)；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；ALB-200高速多功能粉碎机(上海塞耐机械有限公司)；Milli Pore Advantage A10自动纯水机(美国)。

金丝桃苷对照品(批号：111521-201205，质量分数：93.3%)、芦丁对照品(批号：100080-201409，质量分数：92.6%)、槲皮苷对照品(批号：111538-200504，质量分数：98.0%)、槲皮素对照品(批号：0081-9034，质量分数：98.8%)购自中国食品药品检定研究院；异槲皮苷对照品(批号：482-35-9，质量分数：98.6%)购自成都埃法生物科技有限公司；甲醇(色谱纯，赛默飞世尔科技中国有限公司)；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

3批三白草药材(编号：S1，产地：广东梅州；编号：S2，产地：广西玉林；编号：S3，产地：广东江门)，经广东省中医药工程技术研究院刘法锦教授鉴定为三白草科植物三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.。分别将同一批新鲜三白草药材取地上部分，洗净，晾干，剪碎，平均分成3份，分别用冷冻干燥机真空冷冻干燥、烘箱30 ℃干燥和烘箱60 ℃烘干方法进行干燥，至含水量≤13%。再由粉碎机进行粉碎，过四号筛，备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters CORTECS UPLC C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～5 min，10%～13%A；5～12 min，13%～16%A；18～28 min，16%～30%A；28～30 min，30%～100%A)；柱温：25 ℃；流速：0.2 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：2 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素适量，精密称定，用甲醇制成每1 mL分别含芦丁70.58 μg、金丝桃苷60.87 μg、异槲皮苷76.14 μg、槲皮苷75.43 μg、槲皮素19.96 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取三白草样品粉末(过4号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%(体积分数，下同)甲醇50 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 空白样品溶液的制备 取80%甲醇1 mL，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验与专属性试验

分别取混合对照品溶液、供试品溶液、空白样品溶液各2 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图1。可见，空白对照色谱图中在与对照品色谱图相应的位置上无对应色谱峰出现，表明方法专属性良好。

100806040200100806040200100806040200mAUmAUmAU1234512345051015202530t/minABC

1.芦丁； 2.金丝桃苷； 3.异槲皮苷； 4.槲皮苷； 5.槲皮素；A.三白草黄酮混合对照品； B.三白草样品； C.空白样品。

图1超高效液相色谱图
Figure1UPLC chromatograms

2.4 线性关系的考察

精密量取混合对照品溶液0.1、1、2、4、8、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得不同质量浓度的系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，以进样量为横坐标、各峰面积值为纵坐标进行线性回归，5种成分的回归方程和相关系数结果见表1。可见，5种成分在其相应线性范围内均有良好相关性。

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(编号S1，60 ℃烘箱干燥)2 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素的峰面积RSD值分别为0.48%、0.31%、0.30%、0.31%、0.55%(n=6)，均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液(编号S1，60 ℃烘箱干燥)，分别在0、2、4、8、12、24 h各进样1次，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面积的RSD值分别为0.52%、0.94%、0.58%、1.45%、1.36%，均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批样品(编号S1，60 ℃烘箱干燥)，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2. 1”项下色谱条件下分别进样，测定峰面积并计算质量分数。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素质量分数的RSD值分别为1.65%、1.54%、0.78%、1.61%、1.19%，均小于2%，表明方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验

取已知质量分数同一批次的三白草样品(编号S1，60 ℃烘箱干燥)6份，研细，每份0.5 g，精密称定，加入一定量的对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别进样测定，计算加样回收率，结果见表2。

表1 5种黄酮成分线性关系的考察结果Table 1 Results of the linear relationship of the five components

2.9 三白草中黄酮类成分的测定

取不同干燥方法制备的三白草样品(四号筛)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，“2.1”项下色谱条件进样测定，并按外标法计算质量分数，结果见表3。可见，不同干燥条件下，3批三白草药材5种黄酮类成分的质量分数有一定的差异，从大到小的顺序为：烘箱30 ℃干燥>真空冷冻干燥>烘箱60 ℃干燥，烘箱30 ℃干燥对黄酮成分的保留效率最高。

表2 加样回收率试验结果Table 2 The results of the recovery test

表3 不同干燥方式下三白草黄酮类成分的质量分数Table 3 The contents of flavonoid in Saururus chinensis (Lour.) Baill. by different drying methods (n=2) w/(mg·g-1)

3 讨论

3.1 提取条件的优化

分别考察了不同的提取溶剂(甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇)、提取方法(回流、超声)、提取时间(15、30、45 min)对三白草中5种成分提取效果的影响，结果显示回流 30 min时，80%甲醇回流提取效果最佳。

3.2 色谱条件的优化

通过DAD检测器对供试品色谱在200～400 nm 波长范围内进行光谱扫描，综合考虑5种成分，最终选择 254 nm 作为该方法的检测波长。

比较乙腈-水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%H3PO4、乙腈-0.1%甲酸溶液等不同洗脱系统对分离效果的影响，结果表明以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相时，色谱中各待测成分均能达到很好的分离效果，故选择乙腈-0.1%甲酸溶液作为洗脱流动相。

分别比较了柱温为 20、25、30 ℃，流速分别为0.1 mL/min和0.2 mL/min对色谱分离效果的影响，结果表明柱温为 20 ℃、流速为0.2 mL/min时，分离效果比较好。

共考察了3种不同品牌的色谱柱：Waters CORTECS UPLC C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)、Advance Bio Petide plus(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)、ACQUITY UPLC BRH C18(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)的分离效果，结果显示只有Waters CORTECS UPLC C18柱能将金丝桃苷和异槲皮苷的色谱峰分开，因此，选择该色谱柱。

3.3 不同干燥方式的干燥时间比较

烘箱30 ℃干燥对新鲜三白草药材的烘干时间最长，但加工工艺简单，成本较低；真空冷冻干燥耗时长，且对设备要求高、耗能大，不适合批量处理；60 ℃烘箱干燥效率高，温度可控，处理量大，适用于大多数中药材的干燥加工。但本文研究结果显示，60 ℃烘箱干燥对三白草黄酮类成分的保留率较低，不建议采用60 ℃烘箱干燥法对三白草进行干燥。

3.4 不同干燥方法对三白草黄酮类成分质量分数的影响

不同干燥条件下，三白草中黄酮成分质量分数从大到小的排列顺序是烘箱30 ℃干燥>真空冷冻干燥>烘箱60 ℃干燥，在烘箱30 ℃干燥条件下，三白草药材中黄酮成分保留较好。

本研究建立的UPLC法同时测定三白草中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素质量分数方法快速、简便、准确、可靠，可用于控制三白草的质量。不同干燥工艺的黄酮成分保留以烘箱30 ℃干燥为最佳，为三白草的初加工及开发利用提供参考。