巴西蜂胶和国产蜂胶总黄酮、总酚酸含量及自由基清除活性的研究

梁泽宇，余秋恩，尹佳隆，孙圣伟，何健，李坤平

(1.广东药科大学药学院，广东 广州 510006； 2.汤臣倍健股份有限公司，广东 广州 511436)

蜂胶(Propolis)是蜜蜂科昆虫意大利蜂ApismelliferaL.工蜂采集的植物树脂与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的具有黏性的固体胶状物[1]。现代研究证明蜂胶具有抑菌、抗氧化、抗感染、降脂、抗肿瘤及免疫调节等功效[2-5]，其黄酮类成分和酚酸类成分被认为是其主要的活性物质[5-7]。国产蜂胶产量有限而市场需求较大，巴西蜂胶因其特殊的产地来源而具有特殊的生理活性[8-9]，是国内蜂胶市场的有益补充[10]。然而，国内对巴西蜂胶与国产蜂胶化学成分及生物活性的对比研究鲜有报道[11-12]，相关研究工作有待开展。本试验以14份巴西蜂胶和12份国产蜂胶为研究对象，对其总黄酮、总酚酸质量分数及DPPH自由基清除能力进行了比较，以期为其品质评价提供参考。

1 仪器与试药

UV2550型紫外-可见光分光光度仪(日本岛津公司)；MFJ-W300粉碎机(北京利仁科技有限公司)、DL-360A超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)。

没食子酸对照品(质量分数98.2%，批号A0110)和芦丁对照品(质量分数98.7%，批号A0103H)为成都曼斯特科技公司产品。1,1-2-苯基-2-苦基肼(DPPH)和Folin-Ciocalteu试剂均为Sigma公司产品；95%(质量分数，下同)乙醇、甲醇、Na2CO3均为分析纯(广州化学试剂厂)。14批巴西蜂胶和12批国产蜂胶供试样品由汤臣倍健股份有限公司提供，见图1。

图114批巴西蜂胶(A)与12批国产蜂胶(B)供试品

Figure1Fourteen batches of Brazilian propolis samples (A) and twelve batches of Chinese propolis samples (B)

2 方法与结果

2.1 对照品储备液的制备

精确称取芦丁对照品18.0 mg、没食子酸对照品11.0 mg，分别置于25 mL 和10 mL容量瓶中，以95%乙醇溶解，即得0.72 mg/mL芦丁对照品储备液、1.1 mg/mL没食子酸对照品储备液，适当稀释后可用作对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取26批蜂胶样品，每批约20 g，置于-20 ℃冷冻后粉碎，准确称取粉碎后样品各0.100 g，加入3 mL 95%乙醇超声提取60 min，静置，取上清液，过0.45 μm滤膜，即得。

2.3 样品乙醇提取物质量分数的测定

参照GB/T 24283—2018[13]，采用减重法对 26 批蜂胶样品进行了乙醇提取物质量分数测定，每份样品平行测定3次，结果如表1所示。采用GraphPad Prism 6软件对测定结果进行数据处理并作对比箱式图，以Student’st-tests进行差异统计分析，以P<0.01为差异有统计学意义(下同)。见图2。

表1 26批蜂胶乙醇提取物质量分数测定结果

Table1The content of ethanol extract in 26 batches of propolis samples (n=3) %

序号巴西蜂胶xRSD序号国产蜂胶xRSD156.281.021539.561.28257.382.051672.411.55356.811.531756.511.34450.541.121836.672.08553.451.631938.420.75645.611.422058.581.13755.770.252133.941.13849.461.482218.623.76953.201.662332.991.151052.431.652445.281.271155.251.802558.141.221245.521.022632.772.061338.651.571449.600.67

国产蜂胶巴西蜂胶806040200w(乙醇提取物)/%**

**P<0.01。

图214批巴西蜂胶与12批国产蜂胶乙醇提取物质量分数的比较箱式图

Figure2Box plot of ethanol extract content in tested Brazilian propolis and Chinese propolis samples

由表1、图2可知，2组供试样品乙醇提取物质量分数有显著性差异(P<0.01)。 其中，巴西蜂胶乙醇提取物质量分数为52.42%±3.61%；国产蜂胶乙醇提取物质量分数为43.68%±14.60%，其乙醇提取物质量分数组内差异较大。

2.4 总黄酮质量分数的测定

2.4.1 直接比色法测定 参考文献[13-14]，分别精密吸取0.072 mg/mL芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，95%乙醇定容至25 mL，测定波长360 nm，以质量浓度(ρ)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标拟合得相应的回归方程为A=51.278ρ-0.006 9(r=0.999)，在2.88～14.4 μg/mL范围内线性关系良好。精密量取各供试品溶液50 μL，定容至25 mL，于360 nm测定吸光度，计算总黄酮质量分数，每份样品平行测定3次，结果见表2。

2.4.2 Al3+螯合比色法测定 参考文献[13-14]，分别精密吸取0.072 mg/mL芦丁对照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加入 95%乙醇6 mL后，加入Al(NO3)3溶液(100 mg/mL) 0.5 mL和醋酸钾溶液(98 mg/mL) 0.5 mL，加95%乙醇定容至25 mL，摇匀，暗处静置1 h，测定波长415 nm，以质量浓度(ρ)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标拟合得回归方程为A=24.34ρ+0.001 1(r=0.997)，在2.88～14.4 μg/mL范围内线性关系良好。精密量取各批次蜂胶供试品溶液50 μL，同上操作后于415 nm处测定吸光度，每份样品重复测定3次，计算总黄酮质量分数，结果见表3、图3。

由表2、3可知，以直接比色法测定的巴西蜂胶和国产蜂胶供试样品中总黄酮质量分数分别为5.91%±1.68%和10.01%±3.85%；以Al3+螯合比色法测定的巴西蜂胶和国产蜂胶供试样品中总黄酮质量分数分别为7.17%±2.25%和13.51%±6.26%。从图3可看出，采用2种不同方法测定的2组供试蜂胶总黄酮质量分数差异均有统计学意义(P<0.01)，且Al3+螯合比色法测定值均高于直接比色法。

表2 直接比色法测定蜂胶中总黄酮质量分数结果

Table2The content of total flavonoids analyzed by direct colorimetric method (n=3 ) %

序号巴西蜂胶xRSD序号国产蜂胶xRSD17.431.2158.722.3027.721.621616.304.0237.502.931714.080.5844.313.13188.182.9355.492.69198.840.7966.651.412014.161.9376.231.11215.982.2186.731.16223.003.6894.175.53237.480.42107.014.942410.940.96118.030.942514.020.76122.511.59268.321.79132.613.64145.482.31

表3 Al3+螯合比色法测定蜂胶中总黄酮质量分数结果

Table3The content of total flavonoids analyzed by Al3+chelating colorimetric method(n=3) %

序号巴西蜂胶xRSD序号国产蜂胶xRSD19.380.161513.641.5828.470.931624.883.0639.041.101721.271.0745.351.74188.621.9956.972.12199.513.7567.505.092021.761.5178.441.28218.941.7588.072.82223.405.4795.223.62238.487.51108.891.882413.323.351110.332.622513.532.48122.945.432611.732.81133.143.04146.595.43

********2015105030201001510503020100国产蜂胶巴西蜂胶国产蜂胶巴西蜂胶w(总黄酮)/%w(总黄酮)/%w(总黄酮)/%w(总黄酮)/%ⅠⅡAB直接比色法Al3+螯合法直接比色法Al3+螯合法

Ⅰ.直接比色法测定；Ⅱ.Al3+螯合比色法测定；A.巴西蜂胶；B.国产蜂胶。**P<0.01。

图32种方法测定蜂胶中总黄酮质量分数结果的比较箱式图

Figure3Box plots of total flavonoids content in tested Brazilian propolis and Chinese propolis samples by two different methods

2.5 总酚酸质量分数的测定

参考文献[15]，分别精密吸取0.11 mg/mL没食子酸对照品溶液0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，置于5 mL容量瓶内，各加入纯水3 mL，Folin-Ciocalteu试剂0.25 mL，摇匀，静置5 min，再加入 20% Na2CO3溶液0.75 mL，纯水定容，混匀，室温静置30 min后于763 nm波长下测定，以质量浓度(ρ)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标拟合得标准曲线方程A=109.27ρ-0.008 4(r=0.999)，结果在3.3～7.7 μg/mL范围内，线性关系良好。

分别精密吸取26批蜂胶供试品溶液100 μL，加1 900 μL纯水配成稀释液。吸取100 μL稀释液，按上述方法操作后，于763 nm下测定吸光值，依据标准曲线方程计算总酚酸质量分数，每份样品重复测定3次，结果见表4、图4。

表4和图4的结果表明：巴西蜂胶中总酚酸质量分数低于国产蜂胶，二者差异有统计学意义(P<0.01)；但是，国产蜂胶不同批次样品间总酚酸质量分数变化较大，最高达到了28.99%，最低仅为5.87%。

2.6 自由基清除活性的测定

参考文献[16-17]，分别精密吸取适当稀释后的供试品溶液10、25、50、100、200 μL于试管中，并以95%乙醇补至200 μL，再加入DPPH溶液(0.025 mg/mL)3 mL，摇匀；室温静置25 min后，于516 nm测定吸光度Ai，并计算清除率E=(A0-Ai)/A0×100%(A0为空白对照溶液的吸光度)；以样品质量浓度(ρ)为横坐标，清除率(E)为纵坐标作回归曲线，计算EC50(清除率为50%时的样品质量浓度)，结果见表5、图5。

表5、图5结果表明，巴西蜂胶和国产蜂胶供试样品清除DPPH活性的EC50分别为(47.28±21.51) μg/mL和(34.61±21.14) μg/mL ，说明国产蜂胶清除自由基能力稍强一些，但两者差异无统计学意义。

表4 26批蜂胶中总酚酸测定结果

Table4The content of total phenolic acids in 26 batches of propolis samples (n=3) %

序号巴西蜂胶xRSD序号国产蜂胶xRSD113.831.611514.593.21212.392.401628.992.71313.480.661723.952.1748.791.031813.742.47510.423.521914.902.76611.682.832025.324.20713.381.222110.633.27814.151.08225.871.7199.743.882313.200.421013.553.032418.173.111114.680.732519.050.84126.084.252614.051.77135.710.751411.280.75

国产蜂胶巴西蜂胶**403020100w(总酚酸)/%

**P<0.01。

图4巴西蜂胶与国产蜂胶总酚酸质量分数的比较箱式图

Figure4Box plot of total phenolic acids content in tested Brazilian propolis and Chinese propolis samples

表5 26批蜂胶中DPPH自由基清除活性测定结果

Table5DPPH free radical scavenging activity of 26 batches of tested propolis samples

序号巴西蜂胶EC50/(μg·mL-1)回归系数序号国产蜂胶EC50/(μg·mL-1)回归系数132.800.998 81536.690.999 6254.750.999 91623.580.998 6332.790.999 21733.000.999 9456.690.998 61828.790.999 9540.240.999 61926.300.999 6637.340.999 62022.840.999 9738.340.998 52154.250.999 2835.430.999 92288.190.999 9959.170.999 92319.640.999 21031.240.999 72416.470.999 21127.230.998 62513.650.997 21290.950.998 62651.880.999 91393.360.998 61431.520.999 9

国产蜂胶巴西蜂胶**100806040200DPPH自由基清除活性EC50/(μg?mL-1)

**P<0.01。

图5巴西蜂胶与国产蜂胶DPPH自由基清除活性的对比箱式图

Figure5Box plot of free radical scavenging capacity of tested Brazilian propolis and Chinese propolis samples

3 讨论

研究表明，蜂胶的化学物质组成与其产地来源有较大关系。本研究发现，巴西蜂胶的乙醇提取物质量分数高于国产蜂胶，且前者的组内差异也较小；而国产蜂胶乙醇提取物质量分数最高达到72.41%，最低仅为18.62%，差异悬殊，提示不同批次样品品质的一致性较差，相应的蜂胶质量管理需规范。

在诸多文献报道中，黄酮和酚酸类成分被认为是蜂胶主要的活性物质[5-7]，蜂胶总黄酮和总酚酸质量分数与其质量密切相关。本实验结果表明，2种比色法检测所得巴西蜂胶和国产蜂胶总黄酮质量分数之间差异具统计学意义(P<0.01)；相比较而言，国产蜂胶的总黄酮平均质量分数更高，但国产蜂胶不同批次样品中总黄酮质量分数差异亦较大，这可能与我国幅员辽阔，蜂胶的产地、胶源植物和毛胶采收方式各有不同等有关。

黄酮和酚酸类成分的自由基清除活性已被大量的实验研究所证实，蜂胶因含有此类成分而成为天然的自由基清除剂[9,16-17]。本研究中的2组蜂胶样品，尽管其总黄酮、总酚酸质量分数差异显著，且巴西蜂胶质量分数稍低，但其DPPH自由基清除活性差异无统计学意义，这与龚蜜等[16]和Teixeira等[17]的研究结果一致。这说明巴西蜂胶可能含有其他类活性成分，对自由基有较好的清除能力。

综上所述，基于26份供试蜂胶样品，发现巴西蜂胶的乙醇提取物质量分数高于国产蜂胶，而国产蜂胶的总黄酮和总酚酸质量分数高于巴西蜂胶，且差异均具有统计学意义。但值得一提的是，巴西蜂胶和国产蜂胶的清除自由基活性差异无统计学意义，这是否说明巴西蜂胶醇提物中还有其他活性成分，具体有待进一步研究。