高效液相色谱法同时测定金佛止痛丸中的3种成分

王 银，邱连建

(广东深圳市龙岗区中医院，广东 518033)

金佛止痛丸收载于《中国药典》一部[1]，由白芍、醋制延胡索、佛手、三七、郁金、姜黄与甘草7味中药组成，具有行气止痛、舒肝和胃、祛瘀生新的功效，用于气血瘀滞所致的胃脘疼痛，痛经及消化性溃疡、慢性胃炎引起的疼痛[2]。文献报道[3-5]与《中国药典》只对单个成分进行控制，并不能客观地反应其质量。本试验建立了高效液相色谱法同时测定芍药苷、三七皂苷R1、延胡索乙素3种指标成分的含量；该方法高效、准确，可用于金佛止痛丸的质量控制。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260 液相色谱仪，安捷伦公司；XS205DU十万分之一电子天平，梅特勒托利多公司；SB-5200DTS超声波清洗机，宁波新芝生物科技有限公司。

1.2试药 芍药苷对照品(批号110736-201842，含量97.4%)、延胡索乙素对照品(批号110726-201819，含量99.8%)、三七皂苷R1对照品(批号110745-201820，含量93.1%)均购于中国食品药品检定研究院；金佛止痛丸，规格5 g/袋，批号171212、180611、181118，广州白云山中一药业有限公司。乙腈与甲醇均为色谱纯(美国西格玛公司)，磷酸二氢钠为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为安捷伦XBRIDGE-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为乙腈-甲醇(1∶1)，流动相B为0.01 mol/L磷酸二氢钠，梯度洗脱：0～10 min，10% A；10～44 min，10%→40% A；44～50 min，10% A；流速为 1.0 ml/min；柱温为 45 ℃；分段变波长测定：0～20.0 min为230 nm，20.0～32.0 min为280 nm，32.0～50.0 min为203 nm；进样20 μl。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 精密称取芍药苷、延胡索乙素、三七皂苷R1适量，分别置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，得各对照品储备液。再精密吸取各对照品储备液适量置同一50 ml量瓶中，乙醇稀释至刻度，得含芍药苷 1 000 μg/ml、延胡索乙素 20 μg/ml、三七皂苷R1250 μg/ml的混合对照品溶液，备用。

2.2.2供试品溶液 取金佛止痛丸适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置 500 ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理(功率 300 W，频率40 kHz) 30 min，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液 按金佛止痛丸处方比例和工艺，分别制备缺少白芍、延胡索、三七药材的阴性对照样品；并按供试品溶液制备方法制备各阴性对照溶液。

2.3系统适用性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液、缺白芍、缺延胡索及缺三七的阴性对照溶液，按照“2.1”项下所述的色谱条件进行测定，芍药苷、延胡索乙素、三七皂苷R1分离度均符要求，阴性样品溶液对测定无干扰。色谱图见图1。

1.芍药苷 2.延胡索乙素 3.三七皂苷R1

2.4线性关系试验 精密吸取按“2.2.1”项下混合对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 ml，分别置 100 ml 量瓶中，以乙醇定容，摇匀，即得系列质量浓度的混合对照品溶液。分别吸取上述系列混合对照品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，按照“2.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图。以峰面积积分值(Y)对质量浓度(X)进行线性回归，得回归方程，见表1。

表1 线性回归方程

2.5精密度试验 按照“2.1”项下的色谱条件测定混合对照品溶液，重复进样6次，记录芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的峰面积。试验显示，芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1峰面积的RSD值分别为0.7%、1.8%和0.8%，均小于2.0%，表明该方法的精密度符合要求。

2.6重复性试验 取同一批金佛止痛丸(批号171212)6 份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，试验结果显示，芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的质量分数分别为8.114、0.138和1.734 mg/g，RSD 分别为0.4%、1.5%和0.7%，均小于2.0%，表明该方法的重复性符合要求。

2.7稳定性试验 取供试品溶液(批号171212)，按“2.1”项下所述的色谱条件，分别放置0、2、4、6、8和12 h 后进样测定，试验显示芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1质量分数的RSD分别为1.1%、1.9%和1.2%，均小于2.0%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.8准确度试验 取同一批金佛止痛丸(批号为171212)(芍药苷含量8.1 mg/g、延胡索乙素含量0.13 mg/g、三七皂苷R1含量1.7 mg/g)9份，每份约1.0 g，精密称定，分成3组，每组分别加入0.8、1.0和1.2 ml对照品溶液(芍药苷含量8.125 mg/ml、延胡索乙素含量0.135 mg/ml、三七皂苷R1含量1.740 mg/ml)，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的平均回收率分别为99.83%、101.18%和99.96%，RSD分别为0.24%、1.24%和0.79%。见表2-4。

表2 芍药苷加样回收率试验结果(n=9)

表3 延胡索乙素加样回收率试验结果(n=9)

表4 三七皂苷R1加样回收率试验结果(n=9)

2.9样品测定结果 取3批样品，按“2.2.2”项下所述方法进行供试品溶液的制备，按“2.1”项下所述色谱条件测定，外标法计算供试品中芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的含量，结果3批样品芍药苷平均含量为8.121 mg/g，RSD为0.01%；延胡索乙素平均含量为0.135 mg/g,RSD为2.61%;三七皂苷R1平均含量为1.738 mg/g,RSD为0.26%。见表5。

表5 样品中3种成分的含量

3 讨论

中成药的成分相对于化学药成分比较复杂，《中国药典》中对单一成分的控制并不能客观地评价其质量。本试验首次建立了高效液相色谱法同时测定金佛止痛丸中芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R13种指标成分的测定方法。对于多指标的控制，色谱方法的开发尤为重要。本试验结合相关文献与《中国药典》方法，对色谱方法进行了系统开发，包括色谱柱的选择和流动相的优选。同时对于样品的制备方法进行了优化，特别是对提取溶剂与提取方式进行了考查，最终确定试验中的制备方法。在后续的研究中将进一步进行有效成分的筛选，建立更加有效与准确的定量方法。