左归丸对去势大鼠钙转运通路相关蛋白的影响

唐皓 余娜 仇湘中 王哲享

〔摘要〕 目的 探討左归丸去势大鼠骨密度和骨、肾组织中钙转运通路相关蛋白的影响。方法 选取48只雌性SD大鼠，随机分为正常组，假手术组，模型组，西药组，中药低、高剂量组。除假手术组和正常组，其余组切除大鼠卵巢，造模成功后3个月进行各组干预。3个月后处死大鼠，检测大鼠骨密度（BMD）;Western blotting法检测钙转运通路（肾组织）蛋白表达;免疫组化检测去势大鼠骨组织中新型上皮钙通道5（TRPV5）蛋白的表达。结果 与模型组相比，左归丸高剂量组与西药组大鼠骨密度均有改善（P<0.05）;与假手术组比较，模型组各蛋白表达均有不同程度下降（P<0.01，P<0.05）;尼尔雌醇和左归丸均能不同程度上调去势大鼠肾组织中TRPV5蛋白、钠钙交换器（NCX1）蛋白、钙结合蛋白-D28K（CaBP-D28K）和细胞膜钙汞（PMCA1b）蛋白表达，差异均具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;免疫组化显示模型组较假手术组的TRPV5蛋白表达率增加（P<0.05），而西药组和中药高、低剂量组较模型组蛋白表达率均下降（P<0.05）。结论 左归丸可通过上调肾钙转运通路中相关蛋白的表达和降低大鼠破骨细胞中TRPV5蛋白的表达，而发挥骨质疏松症治疗作用，肾、骨组织中钙转运过程相关蛋白可能成为骨质疏松症治疗的新方向、新靶点。

〔关键词〕 左归丸;去势大鼠;钙转运通路

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.10.006

Effects of Zuogui Pills on Calcium Transport Pathway-related Proteins in Ovariectomized Rats

TANG Hao1， YU Na2*， QIU Xiangzhong1， WANG Zhexiang1

（1. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China; 2. Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Zuogui Pills on bone mineral density （BMD） and related proteins involved in calcium transport pathway in bone and renal tissues of ovariectomized rats. Methods A total of 48 female SD rats were randomly divided a normal group， a sham operation group， a model group， a western medicine group， and a low and high dose Zuogui Pills group. Except the sham operation group and the normal group， ovaries of the rats in the other groups were removed， and the intervention of each group was carried out 3 months after the successful establishment of the model. Three months later， the rats were killed to detect the BMD; expressions of proteins involved in calcium transport pathway （renal tissue） was detected by Western blotting; and protein expression of TRPV5 in bone tissue of ovariectomized rats was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the model group， the BMD of rats in the high dose Zuogui Pills group and western medicine group was increased （P<0.05）; compared with the sham operation group， the expressions of proteins in the model group were decreased in varying degrees （P<0.01， P<0.05）; Nilestriol and Zuogui Pills could increase the expressions of TRPV5 （transient receptor potential cation channel， subfamily V， member 5） protein， NCX1 （Sodium-calcium exchanger 1）， CaBP-D28K （Calcium-binding protein-D28K） and PMCA1b （Plasma membrane Ca2-ATPase 1b） in the renal tissue of ovariectomized rats in different degrees， and the differences were statistically significant （P<0.05， P<0.01）; immunohistochemistry showed that the expression of TRPV5 protein in the model group was increased compared with that in the sham operation group （P<0.05）， while the protein expression rates in the western medicine group as well as high and low dose Zuogui Pills groups were decreased compared with that in the model group （P<0.05）. Conclusion Zuogui Pills can play a therapeutic role in osteoporosis by increasing the expressions of related proteins involved in renal calcium transport pathway and decrease the expression of TRPV5 protein in rat osteoclasts. The related proteins involved in calcium transport pathway in bone and renal tissues may become a new direction and target in the treatment of osteoporosis.

〔Keywords〕 Zuogui Pills; ovariectomized rats; calcium transport pathway

近几年骨质疏松的发病人数在我国已经明显上升，在60～70岁阶段，约33%的女性和20%的男性患有该疾病，骨质疏松流行病对中老年人的生命安全、身体健康等形成一定的危害与威胁[1]。到2050年中国骨质疏松症或骨密度低的患者将达到2.12亿[2]，骨质疏松症归属于中医学“骨痿”“骨痹”范畴。中医学认为，肾主骨，肾虚是绝经后骨质疏松症发生的始动病机[3-4]，肾精盛衰直接决定机体生、长、壮、老、已的生命活动状态。而骨的生长发育状况也直接与肾精盛衰密切相关。左归丸是滋阴补肾、填精益髓的名方，实验研究证明，左归丸具有类雌激素作用，能促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞的活性，维持二者的动态平衡，为中医“肾主骨”理论提供了有利的实验依据[5-6]。瞬时性受体电位通道（transient receptor potential，TRP）家族成员新型上皮钙通道5（TRPV5）是已知TRP中钙离子高选择性通道[7]，它在机体钙离子跨上皮转运方面发挥重要作用，参与调节整个机体的钙平衡。其介导的肾钙及骨钙转运过程与骨质疏松症的钙代谢紊乱有着密切的联系。本研究拟基于TRPV5介导的钙转运通路（肾组织、骨组织）探讨补肾经典方剂左归丸对骨质疏松症模型大鼠的疗效及作用机制。

1 材料

1.1  动物与药物

6月龄雌性SPF级SD大鼠48只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物治疗合格证号43004700022760。左归丸配方：熟地黄24 g，山药12 g，枸杞12 g，山茱萸12 g，川牛膝12 g，菟丝子12 g，鹿胶12 g，龟胶12 g（由湖南省中医药研究院附属医院药剂科提供），将药物水煎2次，合并滤液并浓缩致0.48 g（生药量）/mL（相当临床等效剂量）、1.92 g（生药量）/mL浓度的药液（相当于临床4倍量）。尼尔雌醇（购自上海医药（集团）有限公司新华联制药厂生产，国药准字：H31021647，规格2 mg/片）。

1.2  主要试剂

TRPV5（货号17322-1-ap）、CaBP-D28k（货号14479-1-ap）、NCX1（货号55075-1-ap）兔抗体均由（美国）proteintech公司提供;β-actin鼠抗体（货号60008-1-Ig）、PMCAIb（货号ab190355）兔抗体购自英国abcam公司;HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG购自美国Proteintech公司;中性树胶购自Sigma公司;苏木素、PBS（PH7.2-7.6）和枸橼酸盐缓冲液购自Wellbio公司;二步法试剂盒、DBA试剂盒购自中杉金桥公司。

1.3  主要仪器

电泳仪（美国Bio-rad公司）;蛋白酶抑制剂（德国Merck公司）;台式高速冷冻离心机（中国深圳黑马公司）;全自动酶标洗板机和多功能酶标分析仪（汇松公司）;电泳槽（中国北京六一公司）;转膜仪（中国北京六一公司）;包埋机（常州中威电子仪器公司）、显微镜（Motic公司）。

2 方法

2.1  分组

将大鼠随机分成左归丸高剂量组、左归丸低剂量组、西药组、模型组、正常组及假手术组，每组8只。除假手术组和正常组，其余组均切除大鼠双侧卵巢复制绝经后大鼠骨质疏松动物模型。

2.2  造模

造模方法参照文献[8]，10%水合氯醛溶液对大鼠按0.33 mL/100 g体质量腹腔注射进行麻醉，将假手术组大鼠背部切开，进入腹腔，将卵巢找到，從其旁将一定量的脂肪（1 g左右）剪除。将切除卵巢组大鼠距脊柱外侧约1 cm与背部腋中线交叉部位的皮肤切开，腹腔打开，行两侧卵巢摘除术。伤口消毒7 d，观察伤口愈合情况。

2.3  给药剂量及方法

6组大鼠自由摄食、饮水，术后3月行活体骨密度（bone mineral density， BMD）检测验证模型复制成功，进行分组治疗干预。按70 kg的成人一天服用左归丸的生药量为105 g计算，人的给药量为1.5 g/（kg·d），按照动物与人体表面积换算法，大鼠的临床等效给药量应为9.45 g/（kg·d）。每组大鼠的给药体积均为20 mL/（kg·d），根据大鼠每日给药量与给药体积，制备左归丸低浓度煎剂为0.48 g生药/mL（相当于临床等效给药量）、左归丸高浓度煎剂1.92 g生药/mL（相当于临床4倍量）。

中药低剂量组给予左归丸低浓度煎剂（0.48 g/mL），体积为20 mL/（kg·d）;中药高剂量组给予左归丸高浓度煎剂（1.92 g/mL），体积为20 mL/（kg·d）;西药组给予尼尔雌醇1 mL/（kg·d）灌胃，使用前配成混悬液（浓度为0.167 mg/mL），1次/周，其余时间予生理盐水20 mL/（kg·d）灌胃;假手术组和模型组的大鼠给予体20 mL/（kg·d）的生理盐水灌胃饲服。以上干预治疗均持续3个月。

2.4  肾样品和股骨头的标本制备

肾样品制备：剪取大鼠0.25 g肾组织，用冰预冷PBS洗组织，加入200 μL RIPA裂解液于匀浆器中反复研磨组织直至看不见组织块，以备Western Blot法检测大鼠肾组织中TRPV5介导的钙转运通路相关蛋白的表达。

股骨样品制备：将大鼠肌肉筋膜（附着在右后肢股骨）剔掉，以便进行大鼠样本骨密度检测。剪碎大鼠样本的暴露股骨（即大鼠左后肢股骨干骺端），以备免疫组化测试骨样本骨组织中TRPV5蛋白的表达。

2.5  观测指标

2.5.1  大鼠离体股骨上1/3 BMD测定  肌肉筋膜（右后肢全股骨）剔除条件下随之需要选择生理盐水将样本的筋膜洗净，用纱布和锡纸将筋膜裹好，双能X线骨密度仪（XR-26型）进行大鼠样本的骨密度测试，采用The Small Subject Scout Scan软件进行数据研究。

2.5.2  Western Blot法检测大鼠肾组织中TRPV5介导的钙转运通路相关蛋白的表达  通过清洗、蛋白裂解、离心制备好肾样品;随后绘制蛋白标准曲线，算出蛋白浓度。灌胶、上样，根据蛋白定量的结果，计算出所有样品取样量，电泳、转膜。按TRPV5（83KD）、CaBP-D28k（28KD）、NCX1（120KD）、PMCAIb（130-250KD）、β-actin（42KD）所在位置进行切胶;室温条件下于TBST溶液（含5%脱脂奶粉）内封闭膜（载蛋白质条带）60 min。进行一抗孵育、二抗孵育;孵育洗涤后，采用ECL化学发光显示液曝光。

2.5.3  免疫组化测试骨样本骨组织中TRPV5蛋白的表达  将股骨样品切片脱蜡至水;尿素、胰酶修复抗原;加入3% H2O2，室温10 min以灭活内源性酶。PBS冲洗3 min×3次;进行孵育一抗、 孵育二抗、DAB显色;苏木素复染5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝;各级酒精（60%～100%）脱水，每级5 min。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性树胶封片、显微镜观察。使用IPP软件分析图像。

2.6  统计学方法

分析基于SPSS 17.0完成。单因素方差分析多组对比，t检验两组对比，结果用“x±s”表示。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1  大鼠离体股骨上1/3 BMD测定

BMD检测结果：正常组大鼠与假手术组差异无统计学意义。与假手术组相比，模型组大鼠BMD显著降低（P<0.01）。与模型组相比，中药高剂量组、和西药组大鼠BMD均得到改善（P<0.01）。与模型组中的大鼠相比，中药低剂量组大鼠样本BMD升高差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3.2  大鼠肾组织中TRPV5介导的钙转运通路相关蛋白的表达

如图1所示Western法结果如下：和假手术组比较，模型组各蛋白表达均有不同程度下调（P<0.01、P<0.05）;与模型组相比，西药组和中药高剂量组中TRPV5蛋白与NCX1蛋白表达均有上调（P<0.05），CaBP-D28k蛋白表达有明显上调（P<0.01）;与模型组比较，PMCA1b蛋白表达在西药组和中药低剂量组中均有明显上调（P<0.01）。

3.3  大鼠骨组织中TRPV5蛋白的表达

大鼠骨组织中TRPV5蛋白的阳性表达为细胞膜和胞浆被染成棕黄色。模型组TRPV5蛋白的阳性表达较假手术组的阳性细胞表达增加（P<0.05），而西药组和中药高、低剂量组较模型组阳性细胞表达下降（P<0.05）。见表2和图2。

4 讨论

骨质疏松症属于中医学“骨痿”，骨痿中医病理本质核心是“肾虚髓亏”。中医学认为“肾藏精”即肾中精气是人体生理活动的原动力，肾精盛衰决定机体生、长、壮、老、已的生命活动状态。肾中精气不仅促进机体生长发育，同时也保证骨骼正常功能，因此，骨骼的生长发育状况也直接与肾精的盛衰密切相关。左归丸出自明代张景岳的《景岳全书·新方八阵》，主治真阴肾水不足，药物阴阳俱用，寓阳中求阴之意。补肾填精法是防治骨痿的基本大法，所以左归丸作为补肾填精的经典方，在防治骨质疏松症有很好的临床疗效。现代研究也证实左归丸具有类似雌激素样的调节作用，不仅能使血清骨钙素含量增加、降钙素含量降低[9]，升高大鼠骨量，改善骨小梁细小、稀疏和三维结构破坏的状况[10]，还能降低骨髓基质细胞IL-1和成骨细胞IL-6的表达和肾组织中TGF-β1、Smad4的mRNA的表达[11-12]，从而达到纠正钙代谢紊乱，防治骨质疏松症的目的。

钙代谢紊乱是骨质疏松症发病的重要原因之一，钙离子通道的调控直接影响骨的代谢[13]。现代研究证实TRPV5介导的钙转运通路存在于包括人与鼠类、兔等哺乳动物组织器官（如骨組织、肾脏等）。机体内钙稳态的调节主要靠肾、骨等器官的协调平衡，即肾钙滤过与重吸收，及骨钙的沉积与释放，从而达到调节血钙平衡的作用。肾钙的重吸收以及骨钙释放均与新型上皮钙通道TRPV5介导的钙转运通路密切相关。

肾脏是钙平衡重要器官之一，它是通过肾小球的滤过和肾小管的重吸收作用下完成的。现代研究证实TRPV5介导钙离子转运通道，其表达下降或缺乏可使肾小管对钙的重吸收减少[14-15]，这一过程主要是依赖浓度梯度的被动转运过程，也有少量的主动钙转运过程。肾钙重吸收过程也是以主动转运过程为主，CaBP-D28k与钙离子有较高的亲和力，因此在肾脏钙转运过程中发挥着非常重要的作用[16]，主要负责胞内钙离子的缓冲和向基底膜侧的运输。另外在基底膜上的Ca2+-ATP酶，在钙离子出膜转运中起钙泵的作用。位于基底膜的NCX1也是钙离子出胞所必需的溢出机制。而介导钙离子入膜的通道蛋白TRPV5是肾钙转运的主要入膜机制。PMCA是P型ATPase家族中最大的[17]，它是钙离子的流出泵（通常具有高亲和力），钙含量（细胞中）是否能保持稳定状态主要取决于这种物质。

骨是调节钙平衡的关键器官之一，TRPV5作为介导破骨细胞骨吸收的重要通道蛋白，其影响成骨细胞和破骨细胞活性，促进成骨方向的骨代谢转变，提高骨密度已经得到证实[18]。

基于TRPV5与肾钙转运和骨钙转运的联系，本研究试探讨左归丸对TRPV5介导的肾钙、骨钙转运通路相关蛋白的影响。研究发现，模型组去卵巢大鼠骨密度下降，标志着骨质疏松模型大鼠造模成功。采用尼尔雌醇与左归丸干预后，大鼠骨密度均有上升，提示雌激素与左归丸均有抗骨质疏松的作用。模型组大鼠肾组织中TRPV5、CaBP-D28K、PMCA1b、NCX1等介导肾钙转运过程重要通道蛋白均有下降，提示骨质疏松症是因为肾钙转运过程被抑制而致钙代谢紊乱引起。而尼尔雌醇及左归丸均可不同程度的上调上述蛋白的表达，提示左归丸通过上调肾钙转运过程重要通道蛋白而发挥对骨质疏松的治疗作用。而免疫组化结果显示，模型组较假手术组的TRPV5蛋白表达明显增加，而西药组和中药高、低剂量组较模型组TRPV5蛋白表达下降。提示去卵巢大鼠破骨细胞的骨吸收增强，而雌激素及左归丸的抗骨质疏松机制有可能是通过抑制TRPV5介导的破骨细胞的骨吸收而起作用。

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