猪非典型性瘟病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

郭佳琪　杨晓宇　冯宇　杨钒　徐志文　朱玲

摘要：为建立一种快速、准确检测猪非典型性瘟病毒（APV）的方法，根据Genbank发布的APPVNS2基因序列，设计合成1对扩增后目的基因片段大小为500bp的特异性引物。建立的R’T-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）和猪瘟病毒（CSFV）的检测结果均为阴性，该方法对APPV的最低检岀量为1μl4.95×10拷贝，重复性试验中组间、组内试验结果均与预期相符。应用该方法对68份疑似患病的仔猪样品进行检测，阳性病料检出率为7.35%。利用Mega7.0绘制APⅤ系统进化树，对APPⅤ进行遗传进化分析，结果显示本试验检出的APPⅤ（SC株）与中国报道的APPV的亲缘关系较近。建立的APPV RT-PCR检测方法可用于APPV的临床诊断及流行病学检测。

关键词：猪非典型性瘟病毒;RT-PCR;检测

中图分类号：S858281.34+7

文献标识码：A

文章编号：1000-4440（2019）02-0357-06

仔猪先天性震颤（Congenital tremors，CT）会导致仔猪出生后数小时内出现骨骼肌双侧痉挛性收缩，妨碍仔猪站立、步行和寻找乳头3，致使仔猪饥饿和初乳摄入不足，严重的可导致仔猪死亡。一般根据神经系统是否发生病变，将CT分为A型和B型，A型有明显的大脑和脊柱的组织学损伤，B型无损伤45。A型又可分为A～A-V5种亚型，其中只有A-I型与AⅡ型具有传染性。A-型一般认为是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起，以小脑发育不全为特征67。AⅡ型的病因存在一定争议，直到2015年，Hause等通过宏基因组测序发现了猪非典型性瘟病毒（Atypical porcine pestivirus virus，APPV）2016年，Arruda9确定APPV是A的病因。随后，德国、荷兰、奥地利等多个国家先后发现猪群存在APPV流行0。2017年，华南农业大学许古明等1首次发现中国猪群APPV的发生，这使中国兽医学界展开了对APPV的研究。

APPⅤ属于黄病毒科瘟病毒属，该病毒属还包括牛病毒性腹泻病毒1型（Bovine viral diarrhea virus1，BVDV-1）和2型（Bovine viral diarrhea virus-2BVDV-2）、猪瘟病毒（CSFV）和边界病病毒（Borderdisease virus，BDV）及之后发现的其他瘟病毒（Ho[12]1-llke pestivirus APPV是基因组长约11kb的RNA病毒，包含上游5UTR、ORF和下游3UTR，ORF区编码的蛋白质可分为4种结构蛋白（C、Ems、E1、E2）和8种非结构蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[14]。

RT-PCR检测方法对样品纯度要求低，不用分离病毒及培养细胞，具有操作简单快速、成本低、敏感性高等特点5，建立APPV的RT-PCR检测方法对于国内猪非典型性瘟病毒的检测研究具有重要意义。我们根据Gen bank发表的APPⅤ基因组序列，选择APPV MS2基因，建立RT-PCR快速检测方法，通过该方法对采自规模化猪场的疑似患病样品进行检测，并对其阳性样品PCR产物进行基因测序和遗传进化分析，为兽医临床诊断提供一种可靠的检测方法。

1材料与方法

1.1 病毒和病料

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）、伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）和猪瘟病毒（CSFV）均由四川农业大学动物生物技术中心保存。病料（颌下淋巴结、小脑、腹股沟淋巴结等）采自四川省遂宁、邛崃、大邑、崇州、宜宾等地区的规模化养猪场。

1.2 主要试剂

5×Prime script buffer、Prime Script rt enzyme MixI、Oligo dT primer、Random 6 mers，RNase free dH2O、DL2000 DNA marker、Trizol、Taq Hs、10×Reaction buffer（Mg2+free）均購自宝生物工程（大连）有限公司。质粒提取试剂盒（Plasmid Kit I）购自Omega公司。

1.3 APPV引物设计与合成

根据Genbank发表的APⅤ基因组序列，选择APPVNS2基因，应用NCB设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物序列为5′GAACTAAGACCAACACGGAT-3′，下游引物序列为5′-GAGGGTAGGAAGGGAAAG-3′，其预期扩增片段大小为500bp，稀释为20μmo/L备用。

1.4 病毒RNA的提取及反转录

将疑似患非典型性猪瘟的样品充分剪碎，加入液氮研磨成粉末，再加入适量生理盐水保存于EP管中备用。采用Til法提取病料RNA，随后用反转录试剂盒将提取的RNA反转录成CDNA。反转录体系（10.0）：RNase free dH2O 3.51，5×Prime script buffer 2.0ul，Random 6 mers 0.5 ul，Oligo dT primer0.5 ul，Primer Script RT enzyme Mix 10.5 ulRNA模板3.0μ。产物于-20℃冰箱保存备用。

1.5 APPV的RT-PCR方法建立

PCR反应体系（25.0μl）为：eDNA2.0μl，10xReactionbuffer2.5μl，dNTPMix1.0μl，TaqHs0.5μl，上、下游引物各0.5μl，加ddH20至25.0μl。反应条件为：95.0C4min;95.0C30s，58.4C30s，72.0C30s，30个循环;72.0C7min。

1.5.1 Mg2+、TaqHs、dNTPMix用量的优化PCR反应体系总体积25.0μl保持不变，分别调整Mg2*、TaqHs、dNTPMix的用量，對反应体系进行优化。Mg2+用量依次为0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl和3.0μl，TaqHs用量依次为0.1μl、0.2μl0.3μl、0.4μl、0.5μl和0.6μl，dNTPMix用量依次为1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl和3.5μl。在单一变量的情况下，选取目的条带扩增效果最好的试剂用量。

1.5.2 引物用量及退火温度优化在Mg2*、TaqHs、dNTPMix用量优化的基础上，分别改变引物用量（1.0 μl、1.5 μl、2.0 μl和2.5 μl）和退火温度（52.0℃、52.7℃、54.0℃、55.9℃、58.4℃、60.3℃、61.4℃、和62.0℃、），进行PCR扩增，筛选最适引物用量和退火温度。

1.5.3 RT-PCR的特异性试验在上述优化条件下，应用建立的RT-PCR方法对APPV、PRRSV、PRV、CSFV进行特异性检测，设阴性对照组，验证该方法的特异性。

1.5.4 RT-PCR的敏感性试验用质粒提取试剂盒提取APPV质粒，用核酸蛋白质仪测定所构建的阳性质粒浓度，计算出模板的拷贝数。在上述优化条件下，将模板进行倍比稀释进行RT-PCR，以验证本方法的敏感性。

1.5.5 RT-PCR的重复性试验提取APPV阳性病料RNA，以反转录的产物为模板，应用建立的RT-PCR方法分别进行组间、组内重复性试验，以验证本方法的稳定性。

1.6 临床样品检测及阳性样品鉴定

将68份样品病料充分剪碎，加入液氮研磨成粉末，再加入适量生理盐水制得研磨液，-20℃、保存备用。Trizol法提取病料的RNA，随后用反转录试剂盒将提取的RNA反转录成eDNA，然后用建立的RT-PCR方法进行APPV检测，对检测数据进行统计分析。

1.7 遗传进化分析

应用Mega7.0软件对获得的阳性序列、GenBank公布的APPV基因序列和同是黄病毒科瘟病毒属的BVDV-1、BVDV-2、BDV、CSFV等毒株基因序列共同绘制系统进化树，分析APPV的遗传与进化规律，丰富完善APPV流行病学资料。

2 结果

2.1 猪非典型性瘟病毒NS2基因的RT-PCR扩增

将疑似患病样品处理后提取其RNA，用设计的引物进行RT-PCR反应。电泳结果显示，本研究设计的引物扩增出1条约500 bp的条带（图1），与预期结果一致。

2.2 猪非典型性瘟病毒（APPV）RT-PCR检测的优化反应条件

在其他条件不变的情况下对Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix用量单一变量进行优化。结果显示，当Mg*+、Taq Hs、dNTP Mix用量分别为2.5 μl、0.6 μl、1.0 μl时，扩增的条带最为清晰（图2、图3、图4）。

固定25μlPCR反应体系的其他条件不变，对引物用量和引物退火温度进行优化。结果表明最佳引物用量为2.5 μl（图5），最佳退火温度为58.4℃（图6）。

2.3 猪非典型性瘟病毒（APPV）RT-PCR检测的特异性

对建立的APPVRT-PCR检测方法的特异性进行试验，结果表明建立的APPV RT-PCR检测方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）和猪瘟病毒（CSFV）的检测结果均为阴性（图7）。说明本研究建立的方法特异性强，与其他病原无交叉反应。

2.4 猪非典型性瘟病毒（APPV）RT-PCR检测的敏感性

采用建立的RT-PCR检测方法对倍比稀释后的APPV阳性质粒进行扩增，1%琼脂糖电泳观察。用NanoDrop测定6号APPV样品检出量为1 μl4.95x10*拷贝（图8），表明该方法敏感性较强。

2.5 猪非典型性瘟病毒（APPV）RT-PCR检测的重复性

对样品中猪非典型性瘟病毒核酸分别进行组间、组内重复性试验，结果均一致（图9），表明本试验方法的重复性较好。

2.6 建立的APPVRT-PCR检测方法对临床样品的检测应用

利用本试验建立的RT-PCR检测方法对68份疑似患病样品进行检测，共检出阳性样品5份，阳性检出率为7.35%。将5份阳性样品的PCR产物进行测序，测序结果证实目的条带均为APPV NS2基因的特异性片段。测序分析结果与RT-PCR结果高度一致，进一步验证了本试验建立的检测方法的特异性与准确性。

2.7 猪非典型性瘟病毒（APPV）遗传进化分析

将检出的临床阳性样品RT-PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司测序。用Mega7.0软件对APPV阳性样品的基因序列和GenBank已发表的APPV基因序列，以及与APPV同科同属的BVDV-1、BVDV-2、BDV、CSFV等基因序列进行遗传进化分析。结果（图10）表明，本研究中检出的猪非典型性瘟病毒（SC株）NS2基因序列与所有APPV基因参考序列均处于同一分支，与其他APPV核苷酸序列的同源性在92%以_上。SC株与中国报道的APPV的亲缘关系较近，与国外报道的APPV的亲缘关系较远。且与CSFV、BDV及BVDV均不在同一分支内。

3 讨论

猪非典型性瘟病毒（APPV）是中国最近几年才检测出的一种新病毒。人工感染试验证实APPV是一种可以引起A-I型仔猪先天性震颤的病原9]。感染该病毒的仔猪四肢、头部或全身出现有节奏的震颤[16]，强烈的重复性震颤使仔猪无法寻找乳头，导致仔猪母乳摄入不足，严重时会导致仔猪死亡。如果护理得当，大多数仔猪断奶后震颤现象自行消失以。中国养猪业规模庞大，在受影响的养殖场中发现约1%～2%的流行率，由于养猪业的规模和100%淘汰率，AP-PV造成了极大的经济损失[8]，促使我们为兽医临床诊断建立一种简单快速的检测方法。

本试验根据GenBank中已发表的APPVNS2基因序列，设计了1对特异性引物并且成功建立了一种APPV的RT-PCR快速检测方法。特异性试验结果表明，本研究建立的方法可以特异性地从样品中检测出APPV，而与PRRSV、PRV和CSFV等病原无交叉反应，具有较高的特异性。敏感性试验结果表明，建立的RT-PCR检测方法的最低检出量为1 μl4.95x104拷贝。为验证该方法的稳定性，本研究进行了组间、组内重复性试验，结果表明该方法具有良好的重复性。对采自四川省遂宁、邛崃等地区的68份疑似患病样品进行检测，共有5份检测结果为阳性，阳性检出率为7.35%。同时，我们根据阳性产物测序结果利用Mega7.0绘制APPV的系统进化树[17]，发现本研究检测的APPV SC株与其他APPV核苷酸序列的同源性在92%以上，SC株与中国报道的APPV的亲缘关系较近，并且国内大部分APPV分离株与国外分离株位于不同分支，表明国内的APPV的生物学特性、致病性等与国外分离株可能有所区别。以上试验结果均表明，本试验研究建立的APPV RT-PCR检测方法可应用于临床APPV的诊断、检测和流行病学调查，为今后开展APPV的深入研究提供了技术手段，有广阔的应用前景。

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