LC-MS/MS法测定毛曼陀罗中莨菪碱、东莨菪碱和山莨菪碱的含量

2019-09-09 05:33范惠珍
关键词:莨菪东莨菪碱曼陀罗

陈 静 ,张 凤 ,张 锐 ,李 卿 ,范惠珍

(1.宜春学院化学与生物工程学院,江西,宜春 336000; 2.第二军医大学长征医院药材科,上海 20003)

曼陀罗亦称“风茄儿”,为茄科曼陀罗属,一年生草本植物。它是一种历史悠久的药用植物,分布广泛,可用于治疗关节痛、哮喘、咳嗽、胃肠痉挛、神经性偏头痛、止痛、痛风、烫伤、溃疡、狂躁、癫痫症、抑郁症、风湿症、抽搐、跌打损伤等症。生物碱莨菪烷类是曼陀罗中的主要化学成分。也是其主要的毒性以及活性成分[1],并且活性比较高。其中莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱等生物碱具有解痉阵痛、止咳平喘、麻醉镇静的功效[2],并可用于缓解内脏绞痛[3],但对人有剧毒,中毒多见于儿童误食曼陀罗、莨菪等植物的花果所致[4]。曼陀罗中毒的主要表现有口渴舌燥、发音嘶哑、颜面潮红、头晕恶心、呕吐、烦躁不安、语无伦次、瞳孔散大、视物模糊、抽搐痉挛等[5]症状。

曼陀罗具有多种生物活性,可广泛应用于医学、农林业中。随着对其药理作用的不断研究,发现其诸多的药用价值,让莨菪碱更广泛地在临床上与医学上应用,也让其需求量迅速地增长[2]。已经有研究利用曼陀罗毛状根部生产生物碱的报道[6],曼陀罗成分复杂繁多,使用传统的方法 TLC、HPLC、GC-MS等把莨菪碱类完全分离是非常困难的。本研究建立LC-MS/MS方法对曼陀罗中的莨菪碱、东莨菪碱和山莨菪碱的含量进行测定,研究结果显示,该方法简便,灵敏度、重复性好,用时较短,可用于其含量的测定,值得进一步推广。

1 实验材料

1.1 仪器

安捷伦1200液相色谱-G6410A三重四级杆串联质谱联用仪(Agilent,美国),包含G1311A输液泵,G1329A自动进样器,G1316A柱温箱,DAD检测器,G1314BVWD检测器,MassHunter软件控制系统及数据处理工作站(Agilent,美国);labnet定时可调速旋涡混合器(labnet,美国);超声仪(SK7200H型,上海科导超声仪器有限公司);Eppendorf移液器(100、200、1000 μL,德国);容量瓶。

1.2 药材及试剂

标准品:莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱、华法林(上海锐生物科技有限公司)纯度98%)。

待测物:曼陀罗的毛状根部(12个不同批次)(上海长征医院药材科李卿副教授提供),甲醇(Merck,德国)、甲酸(Merck,德国)、乙腈(Merck,德国)、水(屈臣氏)、盐酸(上海裕纳有限公司)、浓氨水(分析纯)。

2 方法与结果

2.1 质谱条件

电喷雾离子源(ESI):正离子;毛细管电压:4000 V;截取锥电压:60 V;气体温度 :350 ℃;气体流速:10 L/min。待测物以及内标华法林的MRM模式参数如表1。

表1 质谱条件Table 1 The conditions of mass spectrometry

2.2 色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm),流动相:乙腈-(0.05%甲酸)水溶液=68:32;柱温:25 ℃;流速:0.3 mL/min;进样量:2 μL;单针时间:3 min

2.3 供试品溶液的制备

精密称取50 mg用蒸馏水冲洗干净并且用滤纸吸去多余水分,50℃烘至恒重的毛状根样品,研磨成干粉;加入10 mL盐酸,超声30 min,冷却、过滤,再用10 mL盐酸分三次洗涤滤渣;与上述过滤液合并,用浓氨水调节pH=9,超声45 min;再加6 mL三氯甲烷,充分振荡;冷冻干燥(20 ℃,2000 rmp)残留物溶于2 mL三氯甲烷中(有黄色不容物,超声3 min)12000 rpm离心5 min,吸取上清液20 μL用甲醇稀释10倍,备用。

2.4 对照品溶液的制备

2.4.1 标准品母液的配制

分别精密称取莨菪碱 0.9 mg、东莨菪碱0.64 mg、山莨菪碱0.88 mg,用甲醇定容至2 mL,作为标准品母液,备用。

2.4.2 线性溶液的配制

将标准品莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱母液用甲醇稀释成浓度分别1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000的混标溶液,备用。

2.4.3 内标的配制

精密取适量标准品华法林用甲醇溶解配制成10 ng/mL,备用。

2.5 线性关系的建立

按照上述2.1与2.2的色谱条件下进行测定,对 2.4.2下的浓度梯度进行测定,以峰面积为纵坐标(Y),浓度为横坐标(X)绘制标准曲线。结果显示,各成分在各自范围内线性关系良好,莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱的线性回归方程分别是 Y=813.8904X+2165.3000(R2=0.9922)、Y=714.1221X+517.4311(R2=0.9892)、Y=872.9971X+1024.4247(R2=0.9952),分别在 1~200、1~1000、1~1000 ng/mL范围内线性关系良好。

2.6 专属性的实验

取适量供试品、对照品、阴性对照溶液各1份,按上述2.1与2.2的色谱条件下进行测定。在同一检测条件下,阴性对照无明显干扰,对照品与供试品在相同的出峰时间分别出现了莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱色谱峰,出峰时间均在1 min左右,用时比较短,分离度高。各成分的色谱图如图1、图2、图3:

图1 样本的色谱图Fig.1 Chromatogram map of the sample

图2 混标的色谱图Fig.2 Chromatogram map of the scopolamine

图3 为阴性对照色谱图Fig.3 Chromatogram map of blank

2.7 回收率实验

精密称取6份相同量的供试品,分别加入相同量的对照品,按上述2.3的方法制备供试品,按照2.1与2.2的测定条件下进行测定,记录各待测成分的峰面积。实验的结果表明,6份供试品中莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱的平均加样回收率分别为:97.17%;97.20%;92.68%;RSD 分别为 1.02%、1.31%、1.41%。RSD≤2,说明样本的处理过程影响小,测定方法的准确度高,结果见表2。

表2 三种成分加样回收率的测定结果Table 2 The results 0f 3 samples recovery test

2.8 重复性实验

同一环境下,同一个操作人员,取6份供试品,分别加入相同量的对照品,按上述 2.1.1的方法制备供试品,在上述2.2与2.3的色谱条件下进行测定,记录各待测成分的峰面积。一份供试品连续进样6次,分别记录供试品莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱的峰面积。RSD分别为1.38%、1.31%、1.21%。说明该实验方法的重复性比较好。

2.9 稳定性实验

相同条件下,同一个操作人员,取同一份供试品,按上述2.1.1方法制备供试品溶液,在上述2.2与2.3的色谱条件下进行测定,在0、2、4、8、12、24 h进样,记录峰面积,结果表明供试品中的3种成分性质在24 h内性质稳定,RSD≤2,说明该方法对24 h内的供试品测定是稳定的,结果如表3。

表3 稳定性实验的结果(ng/mL)Table 3 The results of stability experiments

2.10 样本测定的结果

采用上述建立的 LC-MS含量测定方法,测定12份不用批次的供试品毛曼陀罗中三种成份的含量,按照上述2.3方法进行处理,在上述2.1与2.2的色谱条件下进行测定,每份供试品重复进样3次,其平均值作为曼陀罗中莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱的含量,结果见表4。

表4 曼陀罗中3种成分的浓度分别为(ng/mL)Table 4 The contents of various compounds in 3 mandola

3 讨论

曼陀罗中莨菪碱含量的测定方法目前有酸碱滴定法[8]、反相离子对液相色谱法(GC-MS)[9]、高效相色谱法(HPLC)[10]和气相色谱-质谱法(GC-MS)[11]等。近年来,医疗行业主要采用高效液相色谱法(HPLC)测定曼陀中莨菪碱的含量,但是此方法的灵敏度比较差[7],对流动相的要求比较繁琐[12]。本研究建立 LC-MS/MS方法用于测定曼陀罗毛根部莨菪碱的含量,该方法不仅灵敏度好,流动相仅是采用等度的乙腈-(0.05%甲酸)水溶液=68:32,出峰时间短,实验用时较少,操作简单,并且灵敏度高。

莨菪碱类为典型的生物碱类,按传统的生物碱的提取方法,色谱图出现杂峰较多且分离度不好。本实验采用了酸提取,提取回收率比较高,由于酸提取后过滤困难,因此本实验又分别试了甲醇和三氯甲烷,再进行提取过滤,结果三氯甲烷提取回收率高于甲醇,故选择三氯甲烷作为再提取过滤的溶媒。本试验采用盐酸、浓氨水、三氯甲烷的萃取方法进行提取,不仅提取回收率高,色谱图也比较简单,该方法适合用于曼陀罗中生物碱的提取与分离。

本实验采用的是色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm),对酸性、碱性化合物都表现出很好的分离性能,且分离度比较高。采用此色谱柱不仅出峰时间比较早且峰型好,没有出现拖尾及裂峰等现象。由于上述样本处理中采用了甲醇对样本进行稀释,为了避免溶剂效应,标准品以及内标均采用甲醇进行溶解。

本研究建立的LC-MS/MS的方法能够很好的将曼陀罗中的莨菪碱、东莨菪碱和山莨菪碱提取与分离,此方法操作简单且重复性好,回收率高,可以用于曼陀罗中莨菪碱、东莨菪碱和山莨菪碱含量的测定。

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