乳腺癌组织中TCR-ζ 链的表达及外周血中CD8+CD28+和CD8+CD28-、CD95表达临床意义

王艳梅　吴博　艾庆燕　赵豫凤　杨加周　刘宇宏

[摘要] 目的 分析TCR-ζ鏈在乳腺癌组织中的表达及临床意义。 方法 收集2015年5月～2017年8月延安大学附属医院（以下简称“我院”）经过手术及病理证实的乳腺癌患者30例（对应肿瘤组织标本，癌旁组织），收集同期来我院体检及治疗健康人群、乳腺纤维腺瘤、乳腺囊性增生病各30例作为对照，采用流式细胞技术对乳腺癌组织、癌旁组织及正常乳腺组织TCR-ζ链进行检测，并且检测乳腺癌患者血清CD8+CD28+和CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ链的表达，分析乳腺癌组织、正常乳腺组织及癌旁组织TCRζ链的表达;外周血中各组CD8+CD28+和CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ链表达对比及外周血、癌组织中TCRζ链表达与乳腺癌病理特征的关系。 结果 正常乳腺组织、癌旁组织、乳腺癌组织TCR-ζ链相对表达量差异有统计学意义（P < 0.05），其中癌旁组织、乳腺组织表达水平均高于正常乳腺组织（P < 0.05）。外周血中CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ链等免疫指标在乳腺癌、乳腺纤维腺瘤、乳腺囊性增生病四种类型患者间差异有统计学意义（P < 0.05），其中乳腺癌患者血清CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ链表达水平高于乳腺纤维腺瘤、乳腺囊性增生病及健康人群相应水平，差异有统计学意义（P < 0.05）;外周血TCR-ζ链表达水平与癌原发灶大小、淋巴结是否转移、手术前后及CA125水平关系分析差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 检测外周血TCR-ζ链对乳腺癌患者进行提前筛选、诊断或了解患者病情状况，其在临床上是非常有意义的指标。

[关键词] 乳腺癌;TCR-ζ链;CD8+CD28+;CD8+CD28-;CD95

[中图分类号] R737.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（b）-0097-04

Expression of TCR-ζ chain in breast cancer and the clinical significance of CD8+CD28+ and CD8+CD28- and CD95 expression in peripheral blood

WANG Yanmei1   WU Bo1   AI Qingyan1   ZHAO Yufeng1   YANG Jiazhou1   LIU Yuhong2

1.Department of Histology and Embryology， Medical College of Yan′an University， Shaanxi Province， Yan′an  716000， China; 2.Department of Rheumatology and Immunology， Yan′an University Affiliated Hospital， Shaanxi Province， Yan′an  716000， China

[Abstract] Objective To analyze the expression and clinical significance of TCR-ζ chain in breast cancer tissues. Methods Thirty patients with breast cancer confirmed by surgery and pathology in Affiliated Hospital of Yan′an University （"our hospital" for short） from May 2015 to August 2017 （corresponding to tumor tissue specimens and adjacent tissues） were collected. 30 healthy people， 30 patients with breast fibroadenoma and 30 patients with cystic hyperplasia of breast were examined and treated in our hospital during the same period as control. Flow cytometry was used. TCR-ζ chain was detected in breast cancer tissues， adjacent tissues and normal breast tissues， and the expression of serum CD8+CD28+， CD8+CD28-， CD95， TCR-ζ chain was detected in breast cancer patients. The expression of TCR-ζ chain in breast cancer tissues， normal breast tissues and adjacent tissues was analyzed. CD8+CD28+ and CD8+CD28-， CD95， TCR-ζ chain list in peripheral blood of each group was analyzed. The expression of TCR zeta chain in peripheral blood and cancer tissues was correlated with the pathological characteristics of breast cancer. Results The relative expression of TCR-ζ chain in normal breast tissue， paracancerous tissue and breast cancer tissue was significantly different （P < 0.05）. The expression of CD8+CD28+， CD8+CD28-， CD95， TCR-ζ chain in peripheral blood was higher than that in normal breast tissue （P < 0.05）. There were significant differences among the four types of adenofibroadenoma and cystic hyperplasia of breast （P < 0.05）. The expression levels of CD8+CD28+， CD8+CD28-， CD95， TCR-ζ chain in breast cancer patients were higher than those in breast fibroadenoma， cystic hyperplasia of breast and healthy people （P < 0.05）. The expression of TCR-ζ chain in peripheral blood was significantly correlated with the size of primary tumor， lymph node metastasis， pre-and post-operative levels of CA125 （P < 0.05）. Conclusion TCR-ζ chain in peripheral blood can be used to screen， diagnose and understand the condition of breast cancer patients in advance， which is a very meaningful index in clinical practice.

[Key words] Breast cancer; TCR-ζ chain; CD8+CD28+; CD8+CD28-; CD95

乳腺癌是妇科最为常见的恶性肿瘤之一，流行病学调查资料显示，目前该病的发病率及患病率较高，如果早发现、早诊断、早治疗，乳腺癌的5年生存率高达90%[1]，因此发现早期筛检特异性指标或者诊断指标，详细了解患者病情及免疫状态，对于提高患者治愈率，提高患者生活质量至关重要[2-3]。TCR-ζ链（T cell receptor -ζ chain，CD247）是一种受体激活的蛋白酪氨酸激酶底物，当受体与配体结合后，TCR-ζ链发生酪氨酸磷酸化[4]，参与淋巴细胞活化信号的转导，研究已经发现TCR-ζ链表达与功能改变与慢性炎症和自身免疫性疾病密切相关，主要在T细胞的活化过程中起着作用[5]，具有将受体与细胞内信号转导途径连接的功能[6]，因此设想通过检测该指标的定量表达，对于了解患者病情状况及免疫状况具有重要意义。本研究通过收集乳腺癌相关标本，分析TCR-ζ链在乳腺癌组织中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年5月～2017年8月延安大学附属医院（以下简称“我院”）经过手术及病理证实的乳腺癌患者30例，年龄35～55岁，平均（43.29±3.45）岁，均抽取患者術前和术后外周血5 mL。收集患者肿瘤组织标本30例;收集同期来我院体检及治疗健康人群、乳腺纤维腺瘤、乳腺囊性增生病各30例作为对照。患者收取血清及癌组织样本，对照组经过协议及研究对象同意抽取血清标本及乳腺组织，整个研究通过我院医学伦理委员会批准同意。

1.2 仪器与试剂

仪器：流式细胞仪（ACEA NovoCyte）、PCR仪（美国赛默飞世尔Piko系列）、电泳仪;试剂：细胞裂解液（RIPA Lysis Buffer）、FITC标记流式细胞术用抗体、抗鼠1抗、2抗均购自南京建成生物工程所、破膜剂及固定剂购自Epitomics公司、DEPC溶液、逆转录试剂盒，Trizol总RNA提取液，逆转录酶均购自Takara公司、2%琼脂糖凝胶、SYBR GreenⅠ染料、

1.3 实验方法

1.3.1 样品收集  正常乳腺组织、癌旁组织、乳腺癌组织均来自同一人，癌旁组织为癌组织3 cm以内，正在乳腺组织为癌组织8 cm以外的组织;抽取乳腺癌、乳腺纤维腺瘤、乳腺囊性增生病、健康人群外周血5 mL置于EDTA管中，3000 r/min离心10 min，从-20℃冰箱储存备用。

1.3.2 外周血中CD3+CD247+细胞含量测定  取出血样，3000 r/min离心10 min，收集白细胞层，加入细胞裂解液，混匀后置于4℃冰箱，并且定时混匀;然后1500 r/min离心5 min，再次加入裂解液，混匀;然后PBS缓冲液洗涤两次，然后1 mL PBS混匀后细胞常规计数;根据细胞浓度，取适量体积细胞悬液于流式细胞管中，并且经过重悬，按照相关实验要求加入5 μL抗体，常温避光孵育后加入100 mL固定液，然后PBS冲洗3次。加入100 μL破膜剂及对应抗体，常温孵育20 min，3 mL PBS冲洗3次，继续离心，取适量的PBS容易重悬后上机检测。均设置对照组。

1.3.3 乳腺癌组织中TCR-ζ链基因的定量  ①RNA提取及cDNA合成：采用Trizol总RNA提取试剂盒，然后逆转录酶及随机引物合成母链cDNA，按照常规方法进双链合成。②引物设计：引物委托西安天盾生物科技有限公司设计，TCR-ζ链：Forward primer：GAGGCCTACAGTGAGATTGGG（5′-3′），Tm 59.86，GC% 57.44%;Rever seprimer：GACCCTGGTAAAGGCCATCG（5′-3′），Tm 60.46，GC% 60%。β-ation：Forward primer：AGGAGCGCTCAGTGAGGATTG（5′-3′）;Rever seprimer：GGGGACTCCGCGGAAGGTAATCC（5′-3′）。③RT-PCR实时定量：采用SYBR GreenⅠ染料检测内参与目的基因扩增效率一致性。每个标本进行TCR-ζ链和内参基因检测，总反应体积为25 μL。PCR条件：95℃，2 min，45循环（95℃ 15 s、60℃ 1 min、82℃ 1 s），然后以一定速度，变化温度（95～55℃），并且记录荧光值。④TCR-ζ链定量分析：经过β-actin的RT-PCR确定需要合成cDNA的质量Ct，基因差异表达的倍数即为2-ΔΔCt。其中ΔΔCt=ΔCt乳腺癌（初发）-ΔCt乳腺癌（CR），ΔCt=Ct（总）-Ct（内参）。

1.4 研究指标

比较乳腺癌组织、正常乳腺组织及癌旁组织TCR-ζ链的表达;外周血中各组CD8+CD28+和CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ链表达对比;分析外周血、癌组织中TCR-ζ链表达与乳腺癌的关系。

1.5 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验;计数资料用百分比表示，比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织TCR-ζ链表达比较

经过检测正常乳腺组织、癌旁组织、乳腺癌组织TCR-ζ链相对表达量分别为（8.29±3.14）%、（24.84±5.14）%、（18.83±7.89）%，三组间差异有统计学意义（F = 6.783，P < 0.05），其中癌旁组织、乳腺癌组织表达水平均高于正常乳腺组织（P < 0.05），癌旁组织与乳腺组织表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.2 外周血中各组免疫指标表达比较

外周血中CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ链等免疫指标在乳腺癌、乳腺纤维腺瘤、乳腺囊性增生病四种研究对象间差异有统计学意义（P < 0.05），其中乳腺癌患者血清CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ链表达水平高于乳腺纤维腺瘤、乳腺囊性增生病及健康人群相应水平，差異有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.3 外周血及癌组织TCR-ζ链表达与乳腺癌病理特征关系

癌组织TCR-ζ链表达水平在癌原发灶大小、淋巴结是否转移及CA125水平差异无统计学意义（P > 0.05），外周血TCR-ζ链表达水平与癌原发灶大小、淋巴结是否转移、手术前后及CA125水平相关分析差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

乳腺癌在全球是一种高发的恶性肿瘤疾病，近年来我国乳腺癌发病率呈现明显上升趋势，已成为当前社会的重大公共卫生问题，自20世纪90年代全球乳腺癌死亡率呈现出下降趋势[6];究其原因，一是乳腺癌筛查工作的开展，使早期病例的比例增加;二是乳腺癌综合治疗的开展，提高了疗效[7]。乳腺癌已成为疗效最佳的实体肿瘤之一，但是对于妇女的危害仍然不容忽视[8]。随着现在各种诊断技术发展、生物及免疫学深入，目前乳腺癌治疗主要以根治性手术治疗为主，但是现在临床出现生物治疗措施，临床研究治疗效果较好[9]。免疫学中CD3T细胞的共受体是一种蛋白质复合物，它由4个不同的链组成[10]。在哺乳动物中，该复合物含有1个CD3γ链、CD3δ链和2个CD3ε链[11]。这些链具有被称为一个分子副T细胞受体（TCR）和ζ-链以产生激活信号的T淋巴细胞，TCR，ζ链和CD3分子一起构成的T细胞受体复合物[5]，TCR/CD3复合物是T细胞信号传导的重要结构，TCR/CD3复合物中除了包含TCRα和TCRβ外，构成了信号转导序列[12]。这些信号传导分子中，TCR-ζ链是最为重要的跨膜信号转导分子，TCR-ζ链是一种跨膜信号蛋白，分子量为16 kD，呈高度保守的结构[13]。

免疫T淋巴细胞与乳腺癌的发生发展密切相关，研究表明乳腺癌不同期患者CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+细胞比值明显下降，而CD8+升高，并且随着严重程度，免疫功能降低，说明T淋巴细胞功能可能受到全面的抑制，并且对于肿瘤的治疗和免疫功能的调节起到严重的副作用，因此临床对肿瘤患者免疫功能的调节，对于患者疾病治疗至关重要。有研究发现，目前在多种实体肿瘤、自身免疫性疾病和白血病中都发现了TCR-ζ链表达下调或缺失，这种表达的下调或是缺失可导致机体免疫功能的进一步紊乱[14-15]。TCR-ζ链表达的增加又可以促进T细胞的凋亡，自身免疫性疾病中TCR-ζ链发挥重要的作用[16]。本研究发现TCR-ζ链在乳腺癌组织中表达高于正常和癌旁组织，本研究发现外周血和乳腺癌组织中TCRζ链表达水平都上升，但是外周血经过与乳腺癌相关病理特点，与癌原发灶大小、淋巴结转移、手术前后及CA125水平有关，可以明显发现原发病灶大、发生淋巴转移、手术前及CA125>30 kU/L患者TCR-ζ链表达水平升高，但是对于癌组织组间表现的不是很明显，此外对乳腺良性疾病（乳腺纤维腺瘤、乳腺囊性增生病）TCR-ζ链表达水平相对健康人升高，但是经过统计学分析无意义，说明患者患有乳腺良性疾病患者，免疫系统功能有变化，但是仍然在正常范围内[17-18]。机体抗肿瘤免疫反应是以细胞免疫为主，在应用淋巴细胞免疫检测方法评价，恶性肿瘤时，往往显示出患者的免疫状态低，但是实际情况是大部分患者可能就在早期出现了免疫功能紊乱等，癌的发生、发展和转移是一个有机的、有序的过程，考虑到协T细胞能有效地溶解许多肿瘤细胞[19-20]，鼓舞人们在体内模型中开展协T细胞为基础的肿瘤免疫治疗，但是对未来是一个很好的研究方向。

综上所述，经过检测外周血TCR-ζ链对乳腺癌患者进行提前筛选、诊断及或了解患者病情状况，但是与其他因子或者蛋白的相关性，还需要更加深层次或者多中心研究。

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