川芎酚酸提取纯化及对缺氧神经细胞损伤的影响*

包永睿，王帅，杨欣欣，李天娇，孟宪生

(1.辽宁中医药大学药学院，大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，大连 116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，大连 116600)

川芎为伞形科植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根茎，为常用的活血行气药，具有活血行气、祛风止痛的功效[1]，被广泛用于治疗经闭痛经、头痛、风湿痹痛等。酚酸类成分是川芎中发挥药效的一类主要特征成分，具有抗血小板聚集、清除氧自由基、扩血管等诸多作用[2-4]。随着对川芎化学成分研究的不断深入，分离纯化得到更多、更纯的一类药效物质具有广泛的经济和社会效益。现有关于川芎酚酸类成分纯化多采用D101、AB-8、DA201、DM301、D140等传统常用树脂；随着科技的不断发展，一些专用型、特异性树脂随之出现，为某一特定结构的提取纯化提供了新方法。本实验以此为出发点，采用单因素考察、正交设计等实验方法，筛选川芎酚酸类成分最佳提取方法[5]；采用大孔吸附树脂等技术，通过静、动态吸附与解吸实验，优选川芎酚酸类成分的最佳纯化工艺[6-7]。同时通过体外药效实验研究酚酸类成分对缺氧神经细胞的保护作用，为该类成分在临床的合理应用与工业生产提供参考。

1 实验材料

川芎药材(购于大连民大中药有限公司，批号：C140135，经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为LigusticumchuanxiongHort.的干燥根)；阿魏酸对照品(购于中国食品药品检定研究院，批号：110807-201306)；HPD-600、HPD-400、HPD-300、AB-8、NKA-9、D101、X-5大孔吸附树脂均购于沧州宝恩有限公司；小牛血清(北京全式金生物技术有限公司)；人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y(购于中国科学院上海细胞库)。

2 方法与结果

2.1川芎酚酸类成分提取工艺优选

2.1.1对照品溶液的制备 以阿魏酸为考察指标。精密称取阿魏酸对照品适量，置50 mL量瓶中，加甲醇超声使溶解，制得每毫升含0.046 6 mg的对照品溶液。

2.1.2标准曲线的绘制 参照总酚酸含量测定相关文献报道，本实验拟采用常用三氯化铁-铁氰化钾比色法测定总酚酸含量[8]。精密吸取阿魏酸对照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，分别置25 mL量瓶中，加甲醇至6 mL，加0.3 %十二烷基硫酸钠2 mL，0.6 %三氯化铁-0.9 %铁氰化钾(1：1)混合液1 mL摇匀，在暗处放置5 min，加入1 mol·L-1的冰醋酸溶液至刻度，摇匀，暗处放置30 min，以显色剂为空白，740 nm波长处测定吸光度。以浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，得回归方程：A=105.69C-0.086 6(r=0.999 9，n=6)。阿魏酸对照品在0.046 6～0.161 0 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.3提取因素的考察 通过预实验及相关文献调研，以阿魏酸为考察指标，选取醇浓度、提取次数、提取时间、溶剂用量作为影响因素，通过L9(34)正交设计法进行优化[9-11]，实验设计及结果见表1，方差分析见表2。

表1 川芎酚酸类成分提取工艺正交实验结果Tab.1 Results of orthogonal experiment for the extraction process of Chuanxiong phenolic acid

表2 方差分析Tab.2 Variance analysis

F0.05(2，2)=19.00

由此可知，各因素影响程度依次为A>D>B>C，其中 A(乙醇体积分数)和D(溶剂用量)对提取结果有显著性影响(P<0.05)。考虑到生产的实际情况，最终确定A因素为90%乙醇是最佳提取溶剂。在正交实验结果的基础上，对D(溶剂用量)因素进行细化分析，在10倍量的基础上，对6，8，10，12倍量溶剂进行单因素考察，结果总酚酸含量分别为33.26，33.41，32.63，31.81 mg·g-1，可知溶剂用量为8倍量时，总酚酸含量最高，最终确定D因素为8倍量溶剂是最佳溶剂用量。因此，最优提取工艺为8倍量90%乙醇回流提取3次，每次2 h。

2.1.4工艺验证实验 为合理验证正交实验结果，平行称取3份等量的药材，按上述优化条件提取，验证提取工艺的稳定性，总酚酸含量分别为33.13，32.22，32.87 mg·g-1，总酚酸平均含量为32.74 mg·g-1，RSD为3.47%，与正交实验结果吻合，说明筛选出的提取工艺稳定可行，适合于实际生产应用。

2.2川芎酚酸类成分纯化工艺优选

2.2.1静态吸附与解吸实验 精密称取预处理好的HPD-600、HPD-400、HPD-300、AB-8、NKA-9、D101、X-5等7种树脂各1 g，至100 mL具塞锥形瓶中，加入按最佳提取工艺制备的浓度为0.5 g·mL-1样品溶液10 mL。每10 min振摇20 s，12 h后吸取一定体积上清液，紫外分光光度法测定含量；树脂抽滤至干，边抽滤，边用水100 mL洗涤树脂，90%乙醇20 mL解吸，4 h后吸取一定体积解吸液，紫外分光光度法测定含量。饱和吸附量(mg·g-1干树脂)=[吸附前溶液浓度(mg·mL-1)-吸附后溶液浓度(mg·mL-1)]/干树脂量(g)×吸附液体积(mL)；解吸率(%)=(解吸液浓度×解吸液体积)/(树脂饱和吸附量)×100%。结果见表3。

表3 各大孔树脂的静态吸附与解吸实验结果 Tab.3 Test results of static adsorption and desorption of various macroporous resin

通过静态吸附实验分析，综合各树脂总酚酸的饱和吸附量以及解吸率结果后，HPD-300型树脂可以得到59.34 mg·g-1总酚酸，优于其他型号树脂，最终确定HPD-300为实验用树脂。

2.2.2上样药液浓度考察 取预处理好的HPD-300树脂10 mL4份，湿法上柱，将0.1 g·mL-1川芎提取液150 mL、0.2 g·mL-1川芎提取液75 mL、0.5 g·mL-1川芎提取液30 mL、0.8 g·mL-1川芎提取液20 mL，以每小时2倍体积(bed volume，BV)的流速上样，用90 %乙醇各5 BV以2 BV·h-1流速进行洗脱，收集洗脱液，测定总酚酸的含量。各洗脱液中总酚酸含量分别为243.81，320.48，272.05，232.15 mg确定上样药液浓度为0.2 g·mL-1。

2.2.3泄露曲线考察 取预处理好的HPD-300树脂10 g，湿法上柱，将0.2 g·mL-1川芎提取溶液以流速2 BV·h-1上样，每10 mL收集一次流出液，测定总酚酸的含量。结果总酚酸在上样量为60 mL时出现明显泄露。综合考虑，上样量宜为50 mL，即每克树脂的生药材用量为1 g。结果见图1。

图1 泄露曲线考察Fig.1 Leaking curve

2.2.4上样pH值考察 取预处理好的HPD-300树脂10 g各5份，湿法上柱，取0.2 g·mL-1川芎提取液50 mL，分别用稀盐酸、0.4%氢氧化钠(NaOH)溶液调pH值至2，3，4，7，8，以2 BV·h-1的流速上样，用90%乙醇各5 BV以2 BV·h-1流速进行洗脱，收集洗脱液，测定总酚酸的含量。结果上样pH值为4时，总酚酸的解吸量最大，故确定pH值=4为最佳上样pH值。结果见图2。

图2 上样pH值考察Fig.2 Investigation on pH value of samples

2.2.5洗脱醇浓度考察 取预处理好的HPD-300树脂10 g各5份，湿法上柱，取0.2 g·mL-1川芎提取液50 mL，以2 BV·h-1的流速上样，分别用10%，30%，50%，70%，90%乙醇各5 BV，以2 BV·h-1流速进行洗脱，收集洗脱液，测定总酚酸的含量。结果90%乙醇能将总酚酸有效洗脱，故确定90%乙醇为最佳洗脱溶剂。结果见图3。

2.2.6洗脱醇用量考察 取 HPD-300树脂10 mL，湿法上柱，将0.2 g·mL-1川芎提取液50 mL ，以流速2 BV·h-1上样，先用1倍量水(10 mL)除杂，再用90%乙醇进行洗脱，收集8份洗脱液(每份10 mL)，测定总酚酸的含量，绘制洗脱醇用量曲线。结果5倍量90%乙醇可将近全部总酚酸洗脱下来。故确定洗脱醇用量为5倍量90%乙醇。结果见图4。

图3 酚酸类成分洗脱醇浓度的考察Fig.3 Investigation on the concentration of elution alcohol of phenolic acid

图4 酚酸类成分洗脱醇用量的考察Fig.4 Investigation on the dosage of elution alcohol of phenolic acid

2.2.7除杂体积考察 分别考察1，2，3，4，5BV水洗除杂体积，结果水洗液中总酚酸含量分别为0.10，0.13，0.20，0.24，0.23 mg，水洗除杂体积为2 BV时，酚酸类已有一部分损失，故选择水洗除杂体积为1 BV。

2.2.8川芎酚酸类成分的二次纯化及纯化工艺验证 经过大孔吸附树脂一次纯化后总酚酸的纯度约为20%，因此采用连续过树脂的方法将洗脱液按最佳纯化工艺条件进行二次纯化，平行称取3份川芎药材粉末，按最佳提取方法进行提取，并按最佳纯化工艺进行两次上柱，得到两次纯化产物，计算总酚酸的纯度及收率，见表4。由数据结果可知该纯化工艺稳定性、重复性良好，适合工业生产。分析其纯度升高、收率降低较小的原因，其树脂可能对酚酸成分吸附能力较强，而对其他成分富集较弱，间接证明该树脂对酚酸专属性较强。

2.3川芎酚酸类成分对缺氧神经细胞的保护作用 取对数生长期的人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y，在含体积分数为10%小牛血清的DMEM/F12培养条件下，接种于96孔培养板，每孔100 μL，培养约12 h，待细胞贴壁完全，设加药实验组[加药物和4.5 mmol·L-1连二亚硫酸钠(Na2S2O4)造模剂]、空白对照组(只加细胞，不加药物和造模剂)、模型对照组(加造模剂，不加药物)，每组设5个复孔。继续培养12 h后，每孔避光加5 mg·mL-1噻唑蓝(MTT)20 μL，继续培养4 h后吸净孔内上清液，每孔加入二甲亚砜(DMSO)150 μL，摇床振摇10 min，酶标仪492 nm处扫描，测定吸光度值(A值)，计算存活率，细胞存活率(%)=实验组A/空白对照组A×100%。见表5。

表4 工艺验证结果Tab.4 Results of verification process %

表5 川芎酚酸类成分对缺氧损伤神经细胞的保护作用Tab.5 Protection phenolic acid in chuanxiong on hypoxic injury of neurocytes

实验结果表明，一次纯化组与二次纯化组中1 g生药所含酚酸量分别为28.05，26.38 mg，二者差别不大，但纯度提升38%以后，药效提升了近1倍。

3 讨论

川芎为传统常用中药，目前国内相关研究多集中在化学成分、药理作用、药动学和质量控制等方面，针对川芎总酚酸研究相对较少，且总酚酸提取纯化后纯度较低，仅为51.7%。采用专用新型树脂，在结构、极性方面对分离成分进行有针对性的富集，可以在原基础上大幅度提高川芎总酚酸纯度及收率，为增加有效部位新药研制的瓶颈问题提供新的技术方案。笔者对川芎总酚酸的提取、纯化工艺进行优化，考察了醇浓度、提取次数、提取时间、溶剂用量等提取条件及树脂类型、上样药液浓度、上样量、上样pH值、洗脱醇浓度、洗脱醇用量等纯化条件，获得纯度接近70%，收率为80%的高纯度酚酸类成分。实验结果表明，工艺稳定可靠，适合工业生产，可以为川芎工业生产提供参考。同时，本研究对其不同纯度的酚酸类成分进行了基于缺氧神经细胞损伤保护作用的体外药效实验，结果表明酚酸类成分随着纯度提高，神经保护作用显著增强，呈一定时间、剂量与效应关系，表明川芎酚酸为川芎药材神经保护作用药效物质组分，在后续开展纯化物成分解析实验的基础上，为其临床合理利用及新药开发奠定基础。