山楂细粉对清醒Beagle犬心血管系统的影响*

胡玉霞，常福厚，3，王敏杰，4，李君，王跃武，白图雅，3，吕晓丽，3，肖云峰，刘静

(1.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心，呼和浩特 010110；2.内蒙古自治区新药筛选工程研究中心，呼和浩特 010110；3.内蒙古医科大学药学院药理教研室，呼和浩特 010110；4.内蒙古医科大学基础医学院药理教研室，呼和浩特 010110)

山楂(Hawthorn)为蔷薇科植物山里红(CrataeguspinnatifidaBge var major N.E.Br)或山楂(CrataegusPinnatifidaBge)的干燥成熟果实，秋季果实成熟时采收，切片，干燥[1]。山楂又名红果、棠棣、绿梨、北山楂，气微清香，味酸、微甜，具有消食健胃、行气散瘀的功效[2]。常用于肉食积滞、胃脘胀满、泻痢腹痛、淤血经闭、产后淤阻、心腹刺痛、疝气疼痛、恶露不尽、高脂血症等治疗[3]。现代药理学研究表明，山楂中含有150 多种有效成分，主要包括主黄酮类、维生素类、有机酸类、黄烷及其聚合物类、三萜类和甾体类等[4]。山楂具有调血脂[5]、强心[6]、降血糖[7]、软化血管及降血压[8]、保肝[9]、抗动脉粥样硬化[10]、抗菌[11]、抗肿瘤[12]、抗氧化[13]、调节免疫[14]等作用。山楂为食药二用植物，具有资源丰富、分布广泛、价廉易得等特点，值得推广应用。

目前对于山楂的研究主要集中在山楂的化学成分及药理作用，对于山楂的安全性研究笔者尚未见报道。因此本课题主要研究目的为评价山楂的安全性，通过观察山楂细粉混悬液对清醒Beagle犬心血管系统的影响来初步判定山楂对心血管系统的安全性，为临床应用提供药理毒理依据。

1 材料与方法

1.1药材及试剂 山楂(东营百佳益中药饮片有限公司，批号：20170219)，产地：山东省潍坊市，经内蒙古医科大学生药教研室渠弼老师鉴定为正品。0.5%羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)(天津光复精细化工研究所，批号：20170618)；异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司，批号：217171101)；0.9%氯化钠溶液(山东华鲁制药有限公司，批号：D16070503)。

1.2药液的配制 CMC-Na溶液的配制：称取CMC-Na 5 g，多次少量加入至纯化水中，边加热边用玻璃棒搅拌使其完全溶解，最后定容至1000 mL，备用。

山楂细粉的制备：称取适量山楂饮片，用粉碎机进行粉碎，过孔径0.15 mm(100目)筛，即得山楂细粉。

山楂细粉混悬液的配制：称取适量山楂细粉于配药瓶中，加入约70%总体积的0.5%CMC-Na溶液，先用玻璃棒搅拌溶解后定容至终体积，再用数控超声波清洗器100 Hz振荡10 min，备用。以配制体积1000 mL为例，各给药剂量组信息见表1。

1.3实验动物 Beagle 犬6 只，普通级，雌雄各半，体质量 9.05～12.15 kg(给予首次剂量时)，购自北京玛斯生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0001。Beagle 犬饲养于内蒙古医科大学新药安全评价研究中心普通设施内，实验动物使用许可证号：SYXK(蒙)2014-0003(内蒙古自治区科学技术厅颁发)。动物饲养间保持12 h 昼夜节律，温度控制在20～26 ℃，日温差≤3 ℃，相对湿度 40% ～70%，换气次数≥15次·h-1。动物单笼圈养，每天上、下午定量给食，自由摄取，自由进水。动物经 2 周的检疫期后，进行遥测系统植入子的植入手术，在完全恢复后进行本实验。

表1 山楂细粉混悬液的配制基本信息Tab.1 Basic information for the preparation of fine powder suspension of hawthorn

1.4实验仪器与器械 DSI植入式生理信号遥测系统(包括 TL11M3-D70-PCTR植入子、RMC-1 接收器、计算机采集分析系统、Ponemah 5.0版软件等，美国Data Sciences International 公司)；动物麻醉机(VME2，美国Midmark公司)；千分之一分析天平(BSA4202s，赛多利斯科学仪器有限公司)；数控超声波清洗器(KH-500DV，北京晨曦勇创科技有限公司)；粉碎机(DS-Y350，上海市顶帅工贸有限公司)；电子天平(BSA224s，赛多利斯科学仪器有限公司)；手术刀、手术剪、手术镊、止血钳、持针器、缝针、缝线、穿引器等均为国产器械。

1.5实验方法

1.5.1植入子植入手术 根据DSI公司技术工程师提供的植入子的埋入方法进行植入手术，主要包括麻醉、植入体主体的放置、压力导管的植入和心电电极和呼吸电极的植入。麻醉：用异氟烷进行呼吸麻醉，手术过程维持麻醉(麻醉机标示刻度2.5)；植入子主体放置于犬腹中线稍偏左部位；压力导管埋入腹股沟股动脉里，并预留 U 型回路以避免因腿部活动而引起导管的牵拉。心电图(ECG)检测采用标准Ⅱ导联的方式放置，胸右侧2—3肋间隙与锁骨中线相交处为负极，胸左侧12—13肋骨体与腋中线相交处为正极。呼吸电极由4条导线组成，正极导线和负极导线各2条，2条正极导线放置在胸左侧第7肋骨前后，相距2.5 cm，2条负极导线放置在胸右侧第7肋骨前后，相距2.5 cm，通过检测呼吸阻抗值，确定呼吸电极放置是否合适。手术全程通过DSI生理信号遥测系统和VME2型麻醉机(通过观察气囊的变化检测呼吸频率)实时监测动物状态。动物手术后进入手术恢复期，恢复期为4 周。

1.5.2呼吸校准 待全部动物恢复良好后，开始进行呼吸校准。DSI生理信号遥测系统检测到的呼吸指标为呼吸阻抗，通过呼吸校准将呼吸阻抗转化成呼吸频率、潮气量等常用的呼吸指标。呼吸校准操作包括呼吸传感器的校准(包括激活Ponemah 通道、校正Pneumotach 的软件设置)、用呼吸信号校正阻抗信号(包括软件设置、信号采集和校准)。

1.5.3分组及给药 6 只动物采用拉丁方进行实验设计分组。本品山楂临床成人拟用剂量为9～12 g·d-1，以成人平均体质量70 kg计算，最小用药剂量约为0.12 g·kg-1·d-1。根据国家食品药品监督管理局颁布的《药物安全药理学研究技术指导原则》以及本中心的预实验结果和山楂的最大溶解度，给药剂量设计具体如下：实验分为4 组，分别为溶媒对照组(5‰CMC-Na溶液)和山楂细粉小、中、大剂量组(0.24，0.72，2.16 g·kg-1)。实验设4 个给药周期，相邻给药周期间隔为7 d。

给药方式：选择与临床拟用给药途径相近的灌胃给药，给药体积为10 mL·kg-1；每个给药周期内固定上午10：30 — 11：30 给药。给药剂量与分组设计详见表2 和表3。

表2 Beagle 犬灌胃给药的剂量设计Tab.2 Oral dosage design of Beagle dogs

表3 Beagle 犬灌胃给予山楂细粉混悬液的分组设计(拉丁方设计)Tab.3 Grouping of Beagle dogs orally treated by fine powder suspension of hawthorn (Latin square design)

N：溶媒对照组；L：山楂细粉小剂量组；M：山楂细粉中剂量组；H：山楂细粉大剂量组。
N：solvent control group；L：low dose hawthorn powder group；M：medium dose hawthorn powder group；H：high dose hawthorn powder group.

1.5.4数据采集及记录 利用DSI公司Ponemah软件操作平台(版本5.0)采集动物心电、血压、体温等指标。心电指标包括心率、P-R间期、QRS间期、QT间期、P波、R波、S-T段(取绝对值进行统计)、T波，血压指标包括收缩压、舒张压、平均压。采集给药前2 h及给药后24 h数据。采集间隔为每10 s系统自动记录一次。0～14 h连续测定，之后采集给药后18，24 h时间点数据。统计时选取给药前30 min的时间点为给药前基础值、记录给药后0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，14，18，24 h。剔除因动物躁动等因素导致的数据丢失和大幅度偏移的数据，取每个时间点后5 min数据的平均值作为该时间点数据。

2 结果

2.1对清醒Beagle犬心电指标的影响 山楂细粉混悬液对清醒Beagle 犬心电的影响见表4～11。结果显示：给药前各剂量组所有心电指标均差异无统计学意义(P>0.05)。与溶媒对照组动物在同一检测时间点的数值相比，山楂细粉小、中剂量组动物所有心电指标在所有检测时间点均未见明显改变。山楂细粉混悬液大剂量组动物在给药后心电指标出现如下变化。

心率：在给予大剂量山楂细粉混悬液6，8 h后，动物心率出现降低(P<0.05)，其中以给药后8 h的降低幅度最为明显，与同期溶媒对照组动物心率相比，山楂细粉混悬液大剂量动物心率降低了24.55%。给药后10 h，山楂细粉混悬液大剂量组动物心率恢复正常。

QT 间期：与溶媒对照组动物在同一检测时间点的QT值相比，山楂细粉混悬液大剂量组动物在给药后6 h，QT间期出现延长(F=12.57，P<0.05)。给药后8 h，山楂细粉混悬液大剂量组动物QT间期恢复正常。

除上述心电指标及时间点外，实验未见其他心电指标的改变。

2.2对清醒Beagle犬血压的影响 山楂细粉混悬液对清醒Beagle犬血压的影响见表12～14。结果显示：与溶媒对照组动物在同一检测时间点的数值相比，各实验组动物收缩压、舒张压和平均压在所有检测时间点均未见明显改变。

表4 4组Beagle犬心率比较Tab.4 Comparison of heart rates among four groups of Beagle dogs 次

与溶媒对照组比较，*1P<0.05。
Compared with solvent control group，*1P<0.05.

表5 4组Beagle犬的P波(绝对值)Tab.5 P waves (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表6 4组Beagle犬的P-R间期(绝对值)Tab.6 P-R interval (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表7 4组Beagle犬的QRS间期 (绝对值)Tab.7 QRS interval (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表8 4组Beagle犬的QT间期 (绝对值)Tab.8 QT interval (absolute value)of four groups of Beagle dogs

与溶媒对照组比较，*1P<0.05。
Compared with solvent control group，*1P<0.05.

表9 4组Beagle犬的R波 (绝对值)Tab.9 R waves (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表10 4组Beagle犬的ST段(绝对值)Tab.10 ST segment (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表11 4组Beagle犬的T波Tab.11 T waves (absolute value)of four groups of Beagle dogs

表12 4组Beagle犬的收缩压Tab.12 Systolic blood pressure of four groups of Beagle dogs

2.3对清醒Beagle 犬体温的影响 山楂细粉混悬液对清醒Beagle犬体温的影响见表15。给药前所有动物体温均在正常体温范围内(37.1～38.2 ℃)波动，给药后，与溶媒对照组动物在同一检测时间点的数值相比，不同实验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

表13 4组Beagle犬的舒张压Tab.13 Diastolic blood pressure of four groups of Beagle dogs

表14 4组Beagle犬的平均动脉压Tab.14 Mean arterial pressure of four groups of Beagle dogs

表15 4组Beagle犬的体温Tab.15 Body temperature of four groups of Beagle dogs

3 讨论

安全药理学主要是研究药物在治疗范围内或治疗范围以上的剂量时，潜在的对生理功能的不良影响，即观察药物对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统的影响。根据需要进行追加和(或)补充的安全药理学研究[15]。安全药理学研究能够补充毒性实验观察的不足，为全面了解药物的毒性提供基础，为临床提供更多的药理及毒理信息[16]。在药物的研发过程中，心血管毒性是导致项目中止的重要因素，即使上市后，仍有许多药物因为新发现的毒性而被迫撤市或限制使用。因此，在新药研发阶段，安全性药理学评价有助于发现药物的不良反应，预测不良反应发生的范围和概率或推测药物不良反应机制，也有助于发现药物的新用途和作用机制，为药物研发的可行性及临床应用提供依据[17]。

在进行心血管系统、呼吸系统的安全性评价时，当前药物安全药理学研究技术指导原则和ICH S7A 《人用药物安全药理学研究指导原则》均推荐使用清醒动物模型[18]。与传统的麻醉方式相比，使用清醒动物可有效避免因麻醉药、动物应激导致的动物血压波动、心率下降和QT间期延长等现象的发生，能更好地模拟正常动物给药后在不受束缚情况下的反应；另外经过药物洗脱期后动物可重复给药，符合动物实验减少、优化、替代的3R原则[19]。

本实验利用植入式DSI生理信号遥测系统观察山楂细粉混悬液对清醒Beagle犬心血管系统的影响。结果表明，灌胃给予山楂细粉混悬液0.24和0.72 g·kg-1(约是临床拟用药量的2和6倍)，未观测到清醒Beagle 犬心电指标的明显变化。与溶媒对照组同期检测相比，在给予大剂量山楂细粉混悬液(2.16 g·kg-1，约是临床拟用药量的18倍)6，8 h后，动物心率降低(P<0.05)，在给药后10 h恢复正常。山楂细粉混悬液大剂量组动物在给药后6 h，QT间期出现延长(P<0.05)，在给药后8 h恢复正常。各实验组清醒Beagle 犬的收缩压、舒张压和平均压均未见明显改变，提示其较大剂量的用药对循环系统也较为安全，有利于维护麻醉期间血液动力学的稳定。各实验组动物体温在所有检测时间点均未见明显改变，提示山楂不会干扰体温调节中枢，保证了临床用药的安全性。

在本实验条件下，Beagle 犬灌胃给予小剂量和中剂量山楂细粉混悬液，所有心血管系统指标和体温均未见明显改变，因此认为山楂在临床拟用剂量范围内对心电、血压和体温无明显影响。