江苏地区鲫鱼造血器官坏死病风险分析

袁锐 刘训猛 陈静

摘要[目的]了解江苏省鲫鱼造血器官坏死病的流行情况。[方法]应用PCR方法对2015—2017年的养殖鲫鱼成鱼和苗种进行病原鲤疱疹病毒2型（CyHV-2）检测，并进行风险评估。[结果]共检测样品265例，检出阳性样品32例，阳性率为12.83%，其中阳性率最高的年份阳性率高达25.00%。安徽省主要养殖鲫鱼区域均具有较高感染风险，无论成鱼还是苗种均可感染CyHV-2，而病原的遗传同源性高度统一，提示江苏地区CyHV-2未发生明显变异。[结论]该研究可为江苏地区鲫鱼造血器官坏死病风险分析提供基本数据，并为该病的防控措施提供参考。

关键词江苏省；鲫鱼造血器官坏死病；鲤疱疹病毒2型；遗传同源性；风险分析

中图分类号S941文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）08-0104-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.027

Abstract[Objective] To investigate the prevalence of haematopoietic necrosis of Carassius auratus in Jiangsu Province.[Method]PCR method was used to detect CyHV2 in adult and seedlings of cultured Carassius auratus from 2015 to 2017.And the risk assessment was made. [Result]265 samples were detected，among which 32 positive samples of CyHV2 were detected.CyHV2 positive rate was 12.83%，and the the positive rate was 25.00% in the year with the highest positive rate.C.auratus from main breeding areas of Jiangsu Province had greater risk of infection，both adults and seedlings could be infected with CyHV2.The genetic homology of the pathogen was highly uniform， suggesting that there was no significant variation of CyHV2 in Jiangsu Province.[Conclusion]The research could provide basic data for risk analysis of hematopoietic necrosis of C.auratus in Jiangsu Province， and provide references for the prevention and control measures of this disease.

Key wordsJiangsu Province；Haematopoietic necrosis of Carassius auratus；CyHV2；Genetic homology；Risk analysis

鯽鱼造血器官坏死病是一种由鲤疱疹病毒2型（CyHV-2）引起的急性、出血性并伴有高度传染的流行病，致死率极高[1-2]，近年来在我国内地鲫鱼主养区大规模暴发流行，尤其是江苏地区，发病区域的死亡率在50%以上，严重地区达90%，造成严重的经济损失。该病的主要临床症状为鳃出血并伴有体表和鳍基部出血[3]，发病急、死亡率高，常于春末或初秋两季暴发，造成养殖鲫鱼的大量死亡，目前已蔓延至全球多个国家和地区，遍布亚洲、北美洲、欧洲、大洋洲等[1，3-7]。

CyHV-2自2012年在我国江苏北部鲫鱼主养区被发现后一直呈现蔓延趋势，目前江苏、北京、武汉、广州等地区养殖异育银鲫体内均已检出该病毒[8-9]。除养殖鲫鱼外，我国野生鲫鱼调查结果显示湖北洪湖、安徽巢湖等地的野生鲫鱼也不同程度携带鲤疱疹病毒2型[10]，说明该病毒在我国已经广泛存在。目前，尚缺乏有效控制该病毒的药物和方法，疫苗的研制被认为是防控该病的最有效方法之一。江苏地区作为我国鲫鱼的重要养殖区域，对该病进行跟踪监测，掌握其流行规律，并对存在的主要风险点进行分析，对于疾病的防控具有重要的意义。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂与仪器。

病毒DNA提取试剂盒，为生工生物工程（上海）股份有限公司产品；DL 2000 DNA Marker，为宝生物工程（大连）有限公司产品；Premix TaqTM ，为宝生物工程（大连）有限公司产品；DEPC水，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；高速冷冻离心机 5417R，为Eppendor 公司产品；普通PCR仪，为Bio-Rad 公司产品；凝胶成像仪与电泳仪均为 Bio-Rad 公司产品。

1.1.2引物。参照文献[11]中引物序列，分别合成针对鲤疱疹病毒2型聚合酶基因的1对特异性引物：Polymerase-F引物序列为5′-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3′；Polymerase-R引物序列为5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′，扩增长度均为362 bp。引物由宝生物工程（大连）有限公司产品合成。

1.2方法

1.2.1样品采集与处理。

2015—2017年，在江苏各地鲫鱼养殖区域共采集265份鲫鱼样品，取样品的鳃、肾脏、肝脏、脾脏组织保存于液氮中，带回实验室。若不能立即进行鲤疱疹病毒2型检测，则需要转移到-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2DNA提取。

参照生工生物工程（上海）股份有限公司的病毒核酸提取试剂盒说明书，提取病毒基因组DNA。取鱼鳃组织或肝脏、脾脏、肾脏等组织100 mg，放入1.5 mL离心管中，用一次性研磨棒充分研磨后加入300 μL 裂解液和20 μL 蛋白酶K（20 mg/mL），充分混匀，56 ℃温浴2 h，直到组织消化完全（如果未消化完全，需要再加入蛋白酶K继续消化）；加入200 μL BD缓冲液，混匀，70 ℃温浴10 min；加入300 μL无水乙醇，摇动充分混匀；将以上混合的样品液加入小柱的小管中，室温静置2 min，12 000 r/min离心3 min后，去离心液；加入500 μL PW溶液，10 000 r/min离心1 min，去离心液；加入500 μL洗脱液，10 000 r/min离心1 min，去离心液；10 000 r/min离心2 min，尽量消除残余乙醇；将小柱加入新的1.5 mL离心管中，加入30 μL 洗脱缓冲液到小柱中央，60 ℃温浴5 min，10 000 r/min离心1 min后得到的液体即包含病毒核酸，置于-80 ℃下保存备用。

1.2.3PCR扩增与检测。

以提取的病毒DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）如下：Premix TaqTM 25 μL，上、下游引物各1 μL（浓度为10 μmol/L），DNA模板为2.5 μL，加ddH2O 20.5 μL；PCR反应程序如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶成像扫描仪进行记录。

将阳性扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶回收后，与pMD18-T载体连接过夜，连接产物转化感受态E.coli DH5α，涂布含Amp的LB平板，挑去白色菌落，并进行菌落PCR鉴定，挑选阳性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.4阳性序列同源性比较。使用MEGA7软件进行阳性序列同源性比较和分析。

1.2.5风险评估。根据2015—2017年监测结果以及流行病学调查结果，分析鲫鱼不同养殖阶段、不同养殖模式、不同养殖区域的鲫鱼造血器官坏死病流行风险；根据阳性病原的同源性分析结果，分析毒株的变异风险。

2结果与分析

2.1监测结果

2.1.12015年監测结果。

2015年在江苏省内共采集鲫鱼样品70个，样品主要分布如下：盐城市24个、扬州市11个、淮安市10个、泰州市8个、南京市5个、常州市4个、镇江市4个、徐州市4个。阳性样品检出的电泳结果如图1所示，共检出CyHV-2阳性样品9个，阳性率为12.86%，其中江宁阳性样品2个，宝应、句容、东台、高港、兴化、高邮、大丰各1个。这表明阳性样品主要分布在盐城、扬州、泰州、南京、镇江等江苏省鲫鱼的主要养殖区域。

2.1.22016年监测结果。

2016年在江苏省内共采集鲫鱼样品72个，样品主要分布如下：盐城市24个、扬州市14个、徐州市12个、淮安市10个、泰州市8个、无锡市3个、南京市1个。阳性样品检出的电泳结果如图2所示，共检出CyHV-2阳性样品18个，阳性率达25.00%，其中大丰7个，东台4个、射阳4个、徐州云龙区1个、铜山1个、兴化1个。这表明阳性样品主要集中在盐城这一鲫鱼养殖面积和产量最大的地区，而徐州、泰州也检出少量阳性样品。

2.1.32017年监测结果。2017年在江苏省内共采集鲫鱼样品179个 ，样品主要分布如下：盐城市64个、淮安市31个、扬州市30个、常州市10个、徐州市8个、泰州市8个、无锡市7个，南通市6个、连云港6个、泰州市6个、宿迁市4个、南京市3个。阳性样品检出的电泳结果如图3所示，共检出CyHV-2阳性样品7个，阳性率为3.91%，其中大丰2个，东台2个、射阳2个、江宁1个。结果显示，盐城地区共检出6个阳性样品，南京也检出1个阳性样品。

2.1.4总体流行情况分析。

对江苏省内养殖鲫鱼CyHV-2进行了连续3年的跟踪监测，共检测样品265个，检出阳性样品34个，阳性率为12.83%。其中，2015年CyHV-2阳性率为12.86%，2016年阳性率达25.00%，2017年阳性率为3.91%（图4）。2015—2016年，养殖成鱼的CyHV-2阳性率呈明显升高的趋势，可见CyHV-2对鲫鱼成鱼健康养殖的危害极大。为了探寻CyHV-2在鲫鱼苗种中的携带情况，2017年以苗种场的监测为主，涵盖了包括国家级良种场和省级良种场在内的各类重点苗种场，从监测结果来看，苗种的CyHV-2阳性率明显低于成鱼。这说明相对于苗种生产，鲫鱼养殖过程中感染CyHV-2的风险更高。

2015—2017年CyHV-2阳性样品主要分布在盐城、泰州、南京、扬州、徐州、镇江6市（表1），均为江苏省鲫鱼的主要养殖区域。其中，盐城地区CyHV-2检出阳性数23个，远远高于江苏省其他鲫鱼养殖区域，盐城地区鲫鱼异育银鲫的养殖规模大，产量高，是江苏省乃至全国最重要的异育银鲫产区之一，因此CyHV-2在盐城地区的流行对于江苏省鲫鱼养殖业的危害极大。

2.2同源性结果分析

应用MEGA软件将测得的34个阳性序列与从GenBank数据库中下载的CyHV-2宝应株（BY-JS1：KC841411.1）进行遗传进化分析比较，结果见图5。从图5可以看出，27个阳性序列与宝应株聚在一起，7个阳性序列（均

为2015年检出的阳性样品）未能与宝应株聚在一起，但遗传距离也非常小，表明2015—2017年江苏地区检出的CyHV-2与江苏地区的CyHV-2代表毒株宝应株有极高的遗传相似性，尚未发生明显的变异。

3風险评估

3.1流行风险评估

鲫鱼造血器官坏死病主要感染异育银鲫[4-5，9-12]，一旦暴发则死亡率极高，可造成巨大的经济损失。从2015—2016年监测结果来看，成鱼感染率有明显升高的趋势，病原在江苏各鲫鱼主要养殖区已经普遍存在，而2017年鲫鱼苗种亦检测出阳性样品，表明无论是苗种还是成鱼都可以被CyHV-2感染。由于该病毒存在潜伏感染[13]，既可以水平传播，又能垂直传播[14-15]，因此无论是苗种带毒还是成鱼带毒，鲫鱼感染流行的风险极高。

目前的监测结果表明，CyHV-2只感染养殖鲫鱼，对同池塘养殖的其他鱼类（如草鱼、青鱼、鳊鱼、鲢鱼、鳙鱼等）均不感染，查阅文献也未见其他鱼类感染CyHV-2发病的报道。精养鲫鱼的塘口感染鲫鱼造血器官坏死病的风险极大，近年检出CyHV-2阳性的塘口以单养鲫鱼为主，其他混养塘口则较少检出。因此，相对于其他鲫鱼养殖模式，精养鲫鱼的池塘感染、流行鲫鱼造血器官坏死病的风险较高，同时一旦感染发病，其经济损失也十分巨大。

目前江苏鲫鱼养殖规模十分巨大，最主要的养殖区域为盐城的大丰、射阳、东台等地，此外，扬州、徐州、泰州、淮安、南京、无锡、常州等地也有不少鲫鱼养殖区域。2015—2017年的CyHV-2监测结果表明，盐城地区的感染、流行情况最为严重，是鲫鱼造血器官坏死病感染风险最大的区域，由于盐城地区鲫鱼养殖塘口高度集约，养殖塘口集中、连片，一旦某一个养殖点感染疾病，其传播、蔓延风险极大，容易造成巨大的经济损失，需要重点防控。

3.2病原变异风险评估2015—2017年CyHV-2阳性序列的同源性分析结果表明，当前江苏省的CyHV-2尚未发现明显变异，各阳性序列与CyHV-2宝应株（BY-JS1：KC841411.1）具有极高的同源性，来源比较单一，因此毒株基因变异的风险较小，可以针对毒株尽快进行疫苗的研制。目前已有一些学者开展了相关疫苗研究工作，虽然免疫保护率还不够理想[16-20]，但疫苗作为控制病毒病的最有效手段，未来有望通过灭活疫苗、减毒重组疫苗、基因工程疫苗等来达到防控CyHV-2的目的。

4讨论

鲫鱼是江苏省最重要的养殖经济鱼类，产量超过63万t，是我国鲫鱼养殖第一大省，鲫鱼因其肉质细腻、营养丰富、味道鲜美，深受我国人民喜爱，是人们餐桌上的美味佳肴。然而，随着养殖规模的急剧扩大，各种病害频发，经济损失巨大，尤其是近年来最流行的鲫鱼造血器官坏死病是对鲫鱼养殖危害最大的传染病。该病发病急，死亡率高，幼鱼和成鱼均可感染，危害极大，且流行温度范围较广。目前，国内外可以对该病进行快速、准确诊断，世界各国学者从临床诊断、流行病学、基因组学、防控手段等方面对该病展开了一定程度的研究，但关于防控方面的研究还不够深入，防控手段较为欠缺，CyHV-2仍未能得到有效控制。因此，对该病的发生、传播、宿主流行情况以及病原的同源性进行及时的风险分析，找出关键的风险点，对今后的防控措施研究奠定一个基础是十分必要的。

该研究结果表明，CyHV-2既能感染鲫鱼成鱼，也能感染苗种，而苗种携带病毒使得后期养殖过程中的疾病感染风险巨大，因此开展苗种检疫，及时从源头防止病毒的传播对于防控该病是十分重要的手段；由于目前江苏地区该病毒的毒株来源较为单一，尚未发生明显的变异，因此针对该病毒进行疫苗研制，将是控制该病的最有效手段。

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