猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测方法的建立

张 禹，张 韵，孙世琪，马小军，张小丽*，郭慧琛*

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070；2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜病病原生物学国家重点实验室/OIE/国家口蹄疫参考实验室，甘肃兰州730046)

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)为单链、环状DNA病毒[1]，包括无致病性的PCV1型(PCV1)和有致病性的PCV2型(PCV2)[2]。PCV2不仅引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，还与猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、增生性坏死性肺炎(PNP)以及繁殖障碍等疾病的发生有关[3]，是对猪群危害较严重的一种病原[4]。为了有效控制该疫病的暴发，尽可能降低经济损失，大多数发展中国家采取强制免疫措施。为准确评价免疫效果，目前国际上多采用病毒中和试验(VNT)和液相阻断ELISA(LPB-ELISA)[5]等方法检测免疫畜群的抗体效价。虽然这些检测结果准确可靠，但技术要求高、耗时长，在基层推广有一定难度。近年来国内市场上出现一些利用单一抗原位点的表达蛋白或线性的表位肽作为标记检测抗原的PCV2抗体快速检测免疫层析试纸条[6-7]，均具有操作方便，特异性好的优点，但该方法很难涵盖所有的流行病毒株抗原表位，常导致检测抗体水平与实际免疫情况不符合[8]。

病毒样颗粒(VLPs)是由病毒的衣壳蛋白形成的空心颗粒，具有和天然病毒粒子相同或相似的形态，但不含病毒遗传物质，不能自主复制，粒径大小均一，自身具有佐剂的特性，更容易刺激机体免疫系统产生免疫应答[9-10]，相对于灭活病毒和以Cap蛋白为基础的亚基而言，VLPs具有更强的免疫原性和更高的生物安全性[11]，为准确评估猪群的免疫状态，制定合理有效的免疫方案，本实验用纯化组装的PCV2 VLPs作为抗原，研制了PCV2抗体的金标检测层析试纸条，用于PCV2型疫苗的免疫效果评价，对于及时进行疫苗补种和预防PCV非常有利。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 BSA购自Roche公司；氯金酸购自上海国药公司；G蛋白购自Sigma公司；硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维膜、吸水纸、PVC板、包装外壳均购自GE公司；微电脑自动斩切机及XYZ三维划膜喷金仪均购自上海金标生物公司；PCV2抗体ELISA检测试剂盒购自荷兰赛迪公司。兔IgG、PCV 2抗体阳性血清、阴性血清及A型塞内卡病毒(SVA)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)和O型口蹄疫病毒(FMDV)抗体阳性血清由中农威特股份有限公司、国家口蹄疫参考实验室以及本实验室提供。100份临床PCV 2血清样本采集自甘肃省平凉市庄浪乡某猪场。

1.2 PCV2 VLPs的制备与鉴定 将本实验室制备保存的psKM-Cap/BL21(DE3)阳性克隆菌株[12]在含Can+、Amp+、Chl+培养基中按 1∶100 接种，培养至菌液OD600nm值为0.6～0.8，向菌液中加入终浓度为1 mmol/L的诱导剂(IPTG)，在18℃条件下培养诱导16 h，将菌液收集到离心瓶中4 000 r/min离心30 min，之后用10 mL～20 mL冰浴处理的buffer A(20 mmol/L Tris-HCl， 500 mmol/L NaCl， 5 mmol/L Imidazol，pH8.0)重悬细菌沉淀，冰上超声破碎菌体细胞。在4℃下，将超声后裂解菌液12 000 r/min离心20 min取上清后利用镍亲和层析树脂柱纯化，然后将收集的纯化蛋白装入透析袋中，置于1 L的酶切缓冲液(40 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、1 mmol/L CaCl2、pH7.4)中，在磁力搅拌器上轻微旋转，4℃过夜。切除SUMO标签的结构蛋白自行组装为VLPs。取蔗糖密度梯度离心后的25 μg样品，室温吸附到碳膜包被的铜网上2.5 min，滤纸除去铜网上多余液体，用2%～3%的磷钨酸负染5 min后，滤纸除去多余液体后，使用透射电镜(TEM)分析鉴定VLPs。

1.3 胶体金的制备及质量检测 用柠檬酸三钠还原法[13]制备的胶体金通过紫外分光光度计全波长扫描，确定其最大吸收峰(λmax)；利用TEM观察制备的胶体金，观察胶体金粒径及分布情况。

1.4 胶体金溶液最适pH与G蛋白最适标记量的选择 用0.2 mol/L K2CO3调节胶体金pH至6.5、7.5、8.5、9.5，置于振荡器上充分混匀后再加入浓度为1 mg/mL的G蛋白20 μL，混合均匀，静置5 min后各加入200 μL 10%NaCl溶液，充分混匀，室温静置10 min，不稳定的胶体金聚沉变色，胶体金颜色不发生明显变化者的pH即为最佳pH。

取8只1.5 mL的EP管，各加入1 mL调节为最佳pH的胶体金溶液，之后每管分别加入1 mg/mL的 0、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL G蛋白混合均匀，室温静置10 min后加入10%的NaCl溶液200 μL，室温静置10 min，观察显色情况，G蛋白量不足以稳定胶体金溶液的各孔出现由红变蓝的聚沉现象，而G蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持紫红色不变，选择颜色没有发生变化的最低G蛋白的孔为其最佳标记量。

1.5 免疫胶体金的制备 取调节为最佳pH的胶体金溶液1 mL，按最佳标记量加入G蛋白，磁力搅拌10 min，加入10%BSA至终浓度为1%，磁力搅拌10 min。将制备好的免疫胶体金溶液10 000 r/min离心30 min，将沉淀用金胶缓冲液重悬，4℃保存备用。

1.6 PCV2抗体检测试纸条的制备及最佳蛋白包被量的确定 将标记的胶体金用喷膜仪喷涂于玻璃纤维纸上，37℃干燥，制成金标垫。纯化的VLPs与兔IgG分别稀释至终浓度1.2 mg/mL、1 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL，再用喷膜仪喷于NC膜的不同区域分别作为T带与C带。干燥后封闭，再干燥。将制备好的NC膜、金标垫与样品垫、吸收垫按顺序装配，裁成宽度为2.5 mm的条状，即制成PCV2抗体金标检测试纸条。对PCV2抗体阳性血清以及阴性血清进行检测，根据结果选择NC膜T带与C带的最佳蛋白包被量。

1.7 PCV2血清检测及结果判定 将待检血清50倍稀释后吸取40 μL样品滴在检测试纸条上静置5 min后观察结果。若C带与T带均出现清晰可见红色条带，则结果为阳性(根据T带红色的深浅不同，可分为强阳性、阳性、弱阳性)；若仅C带出现清晰可见红色条带，则结果为阴性；若C带不出现红色条带，则试纸条无效。

1.8 特异性试验 用制备的PCV2抗体检测试纸条检测PCV2抗体阳性血清10份、阴性血清5份以及SVA、PPV、PRV和O型FMDV抗体阳性血清各3份，根据显色结果观察该试纸条的特异性反应以及与其它动物病毒的交叉反应性，分析该方法特异性。在不同的时间重复3次。

1.9 敏感性试验 将PCV2抗体阳性血清50倍稀释，再2倍倍比稀释至1∶50～1∶25 600后滴在制备好的PCV2抗体检测试纸条上，室温静置5 min，观察并判定结果以确定该试纸条的敏感性。

1.10 重复性及稳定性试验 制备PCV2抗体检测试纸条3批，批号分别为：201807、201808、201809。利用其检测不同效价的30份PCV 2血清，每个样品设3个重复。根据各个样品的批间、批内变异系数确定该试纸条是否具有良好的重复性，同时将该试纸条置于4℃保存6个月，每隔30 d检测PCV2抗体阳性及阴性血清，每次检测重复3次，以确定不同保存期内试纸条的稳定性。

1.11 符合率试验 利用制备的PCV2抗体检测试纸条检测100份临床采集的PCV2血清样本，与PCV2 ELISA抗体检测试剂盒的检测结果相比较，并计算试纸条与ELISA试剂盒两种方法的符合率。

2 结果

2.1 PCV2 VLPs的制备与鉴定 将纯化的Cap蛋白在酶切缓冲液中自行酶切、组装，通过蔗糖密度梯度离心经磷钨酸负染后透射电镜观察。结果显示经TEM分析所制备的VLPs粒径为20±1 nm。表明制备的VLPs效果良好，与预期结果相符合。

2.2 胶体金的制备及质量检测 用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金用分光光度计全波长扫描。结果显示，胶体金最大吸光值(Amax)为0.892，最大吸收峰位于(λmax)为520 nm(图1)，表明制备的胶体金符合标记用胶体金的要求。

用TEM分析制备的胶体金。结果显示，所制备的胶体金粒径为20±1 nm，形状规则，分布均匀(图2)。表明制备的胶体金符合使用要求。

图1 胶体金的分光光度计扫描结果Fig.1 Spectrophotometer scan results of colloidal gold

图2 胶体金电镜扫描结果Fig.2 Transmission electron microscopy result of colloidal gold

2.3 胶体金溶液最佳pH值与G蛋白最适标记量的选择 用0.2 mol/L K2CO3调节不同pH值的胶体金，结果显示，在pH为7.5时胶体金颜色不发生明显变化，表明胶体金溶液最适pH为7.5；最适蛋白标记量试验结果见表1，将各管胶体金溶液中分别加入不同浓度的G蛋白、再加入10%NaCl溶液后，室温反应 10 min，结果显示 10 μL/管(10 μg)是胶体金溶液颜色保持紫红色不变的最低蛋白用量，表明1 mL胶体金加10 μL 1 mg/mL的G蛋白应为最佳的标记量。

表1 G蛋白与胶体金最佳标记量的选择Table 1 Selection of optimal labeling concentration of Protein G and colloidal gold

2.4 PCV2抗体检测试纸条的制备及最佳蛋白包被量的确定 经不同浓度的筛选结果显示，采用浓度为0.8 mg/mL的VLPs和1 mg/mL的兔IgG分别做为T线和C线，检测PCV 2抗体阳性血清，结果显示T线和C线均出现紫红色条带，无拖尾现象，检测阴性血清时，T线不显色。表明该包被量下PCV2检测试纸条达到了最佳检测条件。

2.5 特异性试验结果 利用制备的试纸条对PCV2、SVA、PPV、PRV和O型FMDV抗体阳性血清进行特异性交叉试验。结果显示仅PCV2抗体阳性血清呈阳性反应，而PCV2阴性血清及其它病毒血清均呈阴性反应(图3)。表明该试纸条与其它病毒不存在交叉反应，特异性较强。

图3 试纸条特异性试验Fig.3 Specificity of the immunochromatographic strip test

2.6 敏感性试验结果 利用本实验建立的胶体金试纸条检测2倍倍比稀释的PCV2抗体阳性血清，结果显示将其稀释至1∶6 400时仍能够检出，而稀释至1∶12 800时则呈阴性(图4)。表明该试纸条有较高的敏感性。

图4 试纸条敏感性试验Fig.4 Sensitivity of the immunochromatographic strip test

2.7 重复性及稳定性试验结果 选取不同效价的PCV2血清30份，用3批试纸条分别进行批内、批间重复性检测。结果显示30份血清重复测定9次，批内、批间变异系数CV均小于5%，批次间变异程度低；4°保存6个月，其特异性和敏感性无任何变化(表2)。表明制备的试纸条重复性及稳定性较好。

表2 3批试纸条重复性试验结果Table 2 Repeatability test results of three batches

2.8 符合率试验结果 用制备的PCV2抗体检测试纸条检测100份临床采集的血清样本，与荷兰赛迪PCV2 ELISA抗体检测试剂盒的检测结果比较，经计算，PCV2试纸条与ELISA试剂盒的符合率为98%(表3)。表明制备的试纸条与ELISA方法相关性较好，可以用于临床样品的检测。

3 讨论

宋万杰等将去除N端信号肽的Cap截短蛋白(PCV2 dcap)和其单克隆抗体分别喷涂于T线和C线上制备的PCV2抗体检测试纸与ELISA的符合率为99.58%，二者一致性较高，但其敏感性略低[14]。Jin等用胶体金标记PCV2重组Cap蛋白后制备金标垫，T线和C线分别是葡萄球菌蛋白A和纯化的猪抗PCV2抗体，研制成PCV2抗体检测试纸条，能够用于PCV2抗体的现场检测[15]。张文通等分别以重组PCV2 ORF2蛋白和猪IgG作为检测线和质控线，制作了PCV2抗体检测胶体金免疫层析试纸条，其特异性较强但敏感性偏低[16]而本研究将Cap结构蛋白组装为完整的VLPs，作为试纸条检测抗原，不仅克服传统层析方法中纯化病毒造成的生物安全风险，而且与抗原肽或病毒蛋白相比，VLPs作为检测抗原扩大了检测抗原谱，尽可能多的涵盖了抗原位点，减少漏检，使得免疫评价效果更加准确，可靠，更能客观准确的反应抗体的实际水平。

表3 金标试纸条和ELISA方法对100份血清样品的检测结果Table 3 Test results of 100 serum samples by colloidal gold test strip and ELISA method

本研究制备的PCV2抗体金标层析试纸条检测PCV2抗体阳性血清时，将其稀释至1∶6 400时还能检出，说明其敏感性较高；通过对常见猪源SVA、PPV、PRV、O型FMDV及PCV2抗体阳性猪血清检测，表明制备的胶体金试纸条特异性较强。试纸条在4℃保存6个月，其特异性和敏感性无明显变化。本研究将临床采集的血清用试纸条和ELISA方法同时进行检测，结果证实二者具有较高的符合率，达到98%。该方法操作简便，具有更好的安全性、良好的反应性，以及更高的灵敏度及特异性，可以广泛应用于基层。