杆状病毒表达系统制备的重组禽腺联病毒的鉴定

崔潇婷 顾玲玲 吴萌 张继玲 王安平

摘要：为对杆状病毒表达系统制备的重组禽腺联病毒进行生物学特性的鉴定，将含GFP报告基因及AAAV两侧末端重复序列的重组杆状病毒rBac-GFP、表达AAAV结构蛋白的重组杆状病毒rBac-VP、表达AAAV功能蛋白的重组杆状病毒rBac-Rep以感染复数为5，同时感染摇瓶培养中的昆虫细胞Sf9，72 h后收集细胞沉淀，反复冻融3～5次后，离心取上清。经滤膜过滤、氯仿抽提和PEG沉淀后，进行电镜观察和Western blot分析，并体外感染鸡成纤维细胞和鸡肝细胞系。SDS-PAGE结果显示，rAAAV得到了较好的纯化，电镜下可观察到大小约20 nm的典型细小病毒样粒子，Western blot分析数据显示rAAAV由3个结构蛋白组成，与野生病毒相似。体外表达试验结果显示，rAAAV能介导GFP报告基因在鸡细胞中稳定持久地表达。表明杆状病毒表达系统制备的rAAAV具有与野生病毒相似的性质，可应用于后继研究和开发应用。

关键词：重组禽腺联病毒;杆状病毒表达系统;鉴定

中图分类号：S852.65   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）05-0153-03

收稿日期：2017-11-21

基金项目：国家自然科学基金（编号：31302096）;江苏省科技支撑计划（编号：BE2013415）;江苏省六大人才高峰项目（编号：NY-009）。

作者简介：崔潇婷，女，江苏如皋人，讲师，主要从事兽用生物制药的研究。E-mail：419445466@qq.com。

通信作者：王安平，博士，副教授，主要从事兽用生物制药的研究。E-mail：wap4017@163.com。

腺联病毒（adeno-associated virus，AAV）又称腺病毒相关病毒，作为一种新型的病毒载体，与其他重组病毒载体相比较，具有对宿主没有致病性、免疫原性极低、宿主范围广、表达时间持久等优点[1]，因此被认为是一种比较理想的基因转移载体，目前广泛地用于基因治疗和基因工程疫苗等方面的研究。rAAV已有效地转导了小鼠和灵长类动物的多个组织和细胞，并能介导外源基因在肺脏、中枢神经系统、肝脏、视网膜及骨骼肌等器官和组织中的长期表达[2-6]。

禽腺联病毒（avian adeno-associated virus，AAAV）于1973年由Yates等首次发现并报道[7]，AAAV的理化性质、基因组结构等与AAV基本相似，提示可作为有潜力的重组病毒载体开发应用[8-9]。目前，重组禽腺联病毒的制备方法主要是三质粒共转染法，即将顺式（携带ITR 和外源基因）、反式（编码rep和cap）和辅助基因的3 种质粒共同转染293细胞系，这种方法成本偏高、程序较繁、不宜扩大生产，且获得的重组禽腺联病毒滴度偏低。2002年，Masahi 等发现Rep78在昆虫细胞Sf9中无需辅助病毒或质粒就能支持AAV DNA复制[10]，将重组杆状病毒/昆虫细胞系统应用于rAAV的生产，这种方法克服了传统三质粒法的技术难关，rAAV滴度大大提高，生产出的rAAV与使用293细胞生产得到的病毒载体在生物功能上没有差异，杆状病毒/昆虫细胞悬浮生产系统被证明是一种简单、高效、经济的可以大规模生产的方法。

本实验室首次利用重组杆状病毒/昆虫细胞系统制备rAAAV的生产，本研究对昆虫细胞制备的rAAAV进行以系列的鉴定，为rAAAV的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体和细胞

含GFP报告基因及AAAV两侧末端重复序列的重组杆状病毒rBac-GFP，表达AAAV结构蛋白的重组杆状病毒rBac-VP，表达AAAV功能蛋白的重组杆状病毒rBac-Rep均由笔者所在实验室构建并保存;Sf9细胞购自Invitrogen公司;鸡胚成纤维细胞（CEF）用9～11日龄SPF鸡胚制备;鸡胚肝细胞系（CEL）由中国农业科学院生物制品工程技术中心提供。

1.2 工具酶和试剂

昆虫细胞培养基Sf-900ⅡSFM（Serum free medium），购自GBICO公司;HRP标记的羊抗鼠IgG，购自康为世纪生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯级。

1.3 rAAAV-GFP的制备

参照文献[11]的方法，将Sf9昆虫细胞以5×105 cells/mL 的初始密度接种于摇瓶中的昆虫细胞培养基，110 r/min 27 ℃振摇培养，至密度达2×106 cells/mL时，以MOI为5，接种3种重组杆状病毒rBac-GFP、rBac-VP、rBac-Rep。3 d后，离心收集细胞沉淀，于-80 ℃、37 ℃反复冻融3～5次，12 000 r/min离心10 min，收集上清，即为含GFP报告基因的重组禽腺联病毒rAAAV-GFP。

1.4 rAAAV-GFP的纯化

将以上制备的病毒液先用0.22 μm的滤膜过滤，除去杂质和大分子蛋白，再加入1/10体积的氯仿在摇床上室温剧烈振摇1 h，加入5 mol/L NaCl至终浓度为1 mol/L，12 000 r/min 离心10 min，取上层水相，加入PEG 8000至终浓度为10%，冰浴 1 h，12 000 r/min离心15 min，PBS溶解沉淀，即为纯化的rAAAV-GFP。

1.5 rAAAV-GFP的电镜鉴定

将纯化的重组病毒rAAAV-GFP滴加于铜网上，经2%磷钨酸负染后，在投射电镜下观察。

1.6 rAAAV-GFP的Western blot分析

取少量的rAAAV-GFP純化产物，与等体积的2×loading buffer混匀后，煮沸3 min，取15 μL进行SDS-PAGE分析，以未接种病毒的细胞沉淀作为阴性对照。样品电泳结束后转印PVDF膜，以鼠抗VP3多抗作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠作为二抗，按常规方法进行Western blot分析。

[6]Xiao X A，Li J A，Samulski R J. Efficient long-term gene transfer into muscle tissue of immunocompetent mice by adeno-associated virus vector[J]. Journal of Virology，1996，70（11）：8098-8108.

[7]Yates V J，El-Mishad A M，McCormick K J，et al. Isolation and characterization of an avian adenovirus-associated virus[J]. Infec Immun，1973（7）：973-980.

[8]Bossis I，Chiorin J A. Cloning of an avian adeno-associated virus（AAAV）and generation of recombinant AAAV particles[J]. Journal of Virology，2003，77（12）：6799-6810.

[9]Estevez C，Villegas P. Sequence analysis，viral rescue from infectious clones and generation of recombinant virions of the avian adeno-associated virus[J]. Virus Research，2004，105（2）：195-208.

[10]Urabe M，Ding C T，Kotin R M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors[J]. Human Gene Therapy，2002，13：1935-1943.

[11]Wang A P，Wang Y J，Wu S，et al. Efficient production of an avian adeno-associated virus vector using insect cell/baculovirus expression system[J]. Journal of Virological Methods，2017，240：26-31.

[12]Farson D，Harding T C，Tao L，et al. Development and characterization of a cell line for large-scale，serum-free production of recombinant adeno-associated viral vectors[J]. Journal of Gene Medicine，2004（6）：1369-1381.

[13]Durocher Y，Pham P L，St-Laurent G，et al. Scalable serum-free production of recombinant adeno-associated virus type 2 by transfection of 293 suspension cells[J]. Journal of Virological Methods，2007，144（1/2）：32-40.

[14]Lock M，Alvira M，Vandenberghe L H，et al. Rapid，simple，and versatile manufacturing of recombinant Adeno-Associated viral vectors at scale[J]. Human Gene Therapy，2010，21（10）：1259-1271. 李 超，高 麗，王育青，等. 用灰色关联系数法对9个苜蓿品种在田间旱作条件下叶绿素荧光、水分及生产特性的综合评价[J]. 江苏农业科学，2019，47（5）：156-161.