枸杞子水提部位荧光特性研究

戴迪 靳贵林 崔治家 杨扶德 邵士俊

摘要：目的  通过研究枸杞子水提部位的荧光特性，为枸杞子鉴定与质量评价提供依据。方法  采用紫外吸收光谱、荧光激发谱、荧光发射谱、三维荧光光谱的多维光谱结合方法得到枸杞子水提取部位的全方位光谱特征信息，并对特征荧光峰进行表征。结果  枸杞子水提部位有2个明显的特征荧光峰，分别在激发波长（Ex）280 nm/发射波长（Em）340 nm与Ex 340 nm/Em 450 nm处，且荧光强度与浓度有关，受温度、酸碱度、共存离子影响;对照品东莨菪内酯、色氨酸的三维荧光光谱峰位置与之相似。结论  采用水提部位荧光光谱图可对枸杞子进行定性鉴别，特征荧光峰初步推断为以色氨酸为代表的氨基酸类组分和东莨菪内酯类组分。

关键词：枸杞子;荧光特性;三维荧光光谱;中药鉴定

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）07-0079-05

Abstract： Objective To study the fluorescence characteristics of the water extracting parts of Lycii Fructus; To provide a basis for the identification and quality evaluation of Lycii Fructus. Methods Multi-dimensional spectroscopy including ultraviolet absorption spectroscopy， fluorescence excitation spectroscopy， fluorescence emission spectroscopy and three-dimensional fluorescence spectroscopy were used to obtain the omnidirectional spectral characteristics of the water extracting part of Lycii Fructus， and the characteristic fluorescence peaks were characterized. Results There were two distinct characteristic fluorescence peaks in the water extracting parts of Lycii Fructus， which were at Ex 280 nm/Em 340 nm and Ex 340 nm/Em 450 nm， respectively. The fluorescence intensity was related to concentration， affected by temperature， pH value and coexisting ions; the three-dimensional fluorescence peak positions of scopoletin and tryptophan were similar to Lycii Fructus. Conclusion The fluorescence spectrum of the water extracting parts can be used to qualitatively identify Lycii Fructus. It is preliminarily concluded that the characteristic fluorescent peaks were the amino acid component represented by tryptophan and scopoletin component.

Keywords： Lycii Fructus; fluorescence characteristics; three-dimensional fluorescence spectroscopy; identification of TCM

枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，其味甘性平，有滋补肝肾、益精明目功效[1]。研究表明，枸杞子具有调节免疫、抗肿瘤、清除氧自由基、抗脂质过氧化、抗疲劳等多种药理作用[2-8]。枸杞的某些化学成分具有发射荧光的特性，如黄酮类、生物碱类、酚酸类、氨基酸与蛋白质等，目前枸杞的定性定量鉴别主要采用紫外光谱、红外光谱、液相色谱等方法[9-12]，但对其荧光光谱特性鲜有报道。中药传统用药为水煎剂，前期试验发现枸杞子水提液具有良好的荧光性质，故有必要深入研究其全谱信息。本研究采用多维光谱方法得到枸杞子水提取部位的全面光谱信息，对影响荧光的因素进行考察，并初步研究其特有的荧光组分，对荧光峰的归属进行表征，为枸杞子的快速鉴别和质量评价提供参考。

1  仪器与试药

Lambda35紫外可见分光光度计（美国PerkinElmer公司），Fluorolog-3荧光光谱仪（美国HORIBA公司），PB-10/C标准型pH计（Sartorius），JB-040S洁盟牌超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）。

枸杞子样品采集于宁夏自治区中宁县，经甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实。色氨酸（上海麦克林生化科技有限公司，批号C10024582）、苯丙氨酸（国药化学试剂有限公司，批号20141211）、酪氨酸（国药化学试剂有限公司，批号20150208）、東莨菪内酯（成都普思生物科技股份有限公司，批号PS1345-0025）、葡萄糖（国药化学试剂有限公司，批号10010518）、果糖（中国食品药品检定研究院，批号111504-200001），水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2  方法与结果

2.1  荧光光谱测定条件优化

参数设置会影响图谱结果，测试范围需要包含荧光特征峰波段。狭缝越窄，灵敏度越低;狭缝太大则分辨率随之降低，同时狭缝杂散光更容易进入。激发狭缝（Ex Slit）越大荧光强度越弱，发射狭缝（Em Slit）越大荧光强度越强。最终选择三维荧光光谱测试条件为：激发波长（Ex）范围250～450 nm，采样间隔10 nm，Ex Slit 2 nm;发射波长（Em）范围250～600 nm，采样间隔10 nm，Em Slit 2 nm;积分时间0.2 s。

2.2  溶液的制备

枸杞子样品于60 ℃烘干至恒重，粉碎后过65目筛，准确称取0.4 g粉末置于试管中，加入20 mL蒸馏水，40 ℃超声（功率240 W，频率40 kHz）30 min，抽滤，滤液转移至100 mL容量瓶中，以超純水定容，得到每毫升相当于4 mg药材的水提液，作为母液（浓度4.00 mg/mL），用时适当稀释。

将0.04 mol/L磷酸、硼酸和醋酸的混合液，加入0.2 mol/L NaOH溶液，在酸度计上调至所需pH值，配制成pH 2～12的系列Britton-Robinson缓冲溶液。

2.3  枸杞子水提部位光谱信息

枸杞子水提部位的三维荧光等高线光谱见图1，图中等高线表示荧光强度。结果表明，枸杞子水提部位在Ex 280 nm/Em 340 nm与Ex 340 nm/Em 450 nm处有2个荧光峰，分别标记为Peak1、Peak2。枸杞子水提部位紫外吸收光谱见图2，在200～350 nm范围内均有吸收，在波长260 nm处有吸收峰值。

通过选择合适的激发波长和发射波长，分别绘制Peak1、Peak2对应的枸杞子水提部位2种主要荧光组分的二维荧光光谱。组分A和组分B的激发光谱和发射光谱分别见图3、图4。

2.4  影响因素考察

2.4.1  浓度对荧光强度的影响

根据荧光分析的一般规律，稀溶液中荧光强度和荧光物质的浓度成正比，荧光物质浓度较大时会发生自猝灭，使荧光强度降低。将新制的枸杞子母液配制成不同浓度（0、0.004、0.008、0.012、0.04、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg /mL），在Ex 340 nm/Em 450 nm处测定荧光强度，考察浓度对体系荧光强度的影响。不同浓度枸杞子水提液三维荧光等高线光谱见图5。可以看出，在一定浓度范围内，Peak1、Peak2荧光强度随浓度升高而升高，浓度较小时水拉曼峰明显干扰Peak1，浓度为0.4 mg/mL时2个荧光峰强度相当、等高线疏密适中，故选择0.4 mg/mL作为考察浓度。不同浓度枸杞子水提液紫外吸收光谱见图6。紫外吸收随浓度升高而增大，很多物质在此波段有吸收，波长260 nm处吸收峰特征性不强。对比图5和图6可以看出，三维荧光光谱可以提供更多特征性的光谱信息。在0.1～0.8 mg/mL范围内，Peak1、Peak2对应的荧光组分A、组分B的荧光强度随浓度升高而升高，见图7、图8。

2.4.2  放置时间对荧光强度的影响

新配制枸杞子水提液，考察放置时间对体系荧光强度的影响。于4 mL比色管中加入0.4 mL母液，用超纯水配制成0.4 mg/mL溶液，平行配制3份，在48 h内间隔一定时间测试，记录Ex 340 nm/Em 450 nm的荧光强度，结果枸杞子水提液荧光强度稳定，在48 h内变化很小，见表1。

2.4.3  温度对荧光强度的影响

通常温度对溶液的荧光强度有显著影响。由于分子运动和能量转换，一般规律是，随着温度升高，溶液的荧光强度会降低。于4 mL比色管中加入0.4 mL母液，用超纯水配制成0.4 mg/mL溶液，平行配制3份，在不同温度进行测试，记录Ex 340 nm/Em 450 nm的荧光强度，结果见图9。

2.4.4  pH值对荧光强度的影响

荧光组分大多数是含有酸性或碱性基团的芳香族化合物，溶液pH值对荧光强度有很大影响。于10 mL容量瓶中加入1 mL母液，然后用pH 2～12的Britton- Robinson缓冲溶液定容，平行配制3份，考察溶液pH值对体系荧光强度的影响，结果见图10。

2.4.5  共存物对荧光强度的影响

在枸杞子水提液中加入高浓度葡萄糖、果糖、HSO3-、Cd2+、Cu2+、Pb2+、Hg+后定容到枸杞子水提液浓度为0.4 mg/mL，考察共存物对体系荧光的影响。结果表明，葡萄糖、果糖、HSO3-、Cd2+、Cu2+等离子均对枸杞子水提液三维荧光光谱荧光峰无明显影响，不干扰测定。含Pb2+枸杞子水提液的三维荧光光谱荧光峰红移，荧光强度减弱;含Hg+枸杞子水提液的三维荧光光谱荧光强度减弱，峰形不变。

2.5  荧光峰初步推断

已有文献报道东莨菪内酯、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸荧光峰值[13-15]，故测试这些对照品的三维荧光光谱，见图11。氨酸类在Ex 250～300 nm/Em 300～350 nm左右出峰，与水提部位特征荧光峰Peak1接近;东莨菪内酯光谱峰在Ex 340 nm/Em 450 nm左右，与水提部位特征荧光峰Peak2相似。东莨菪内酯和色氨酸混合三维荧光光谱峰与枸杞子水提部位特征荧光峰相似，见图12。

3  讨论

枸杞子药用历史悠久，传统经验鉴别以色红、粒大、籽小、肉厚、质柔、味甜者为佳，运用现代分析技术可对枸杞子进行更全面评价。枸杞子化学成分复杂，本研究结合多维光谱的方法，发现其三维荧光光谱图中只出现2种组分的荧光峰，可用于枸杞子的定性鉴别，初步推测其中一组为以色氨酸为代表的氨基酸类组分的特征荧光峰，另一组为东莨菪内酯类组分的特征荧光峰。枸杞子水提部位荧光稳定性好，不易受离子干扰，2种组分的荧光发射峰相距110 nm，选择合适的测量波长可以分别绘制2种组分的二维荧光光谱。在实验条件一定时，2种组分的荧光强度均与浓度呈良好的线性关系，可作为2种组分定量分析的基础。

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