几种酶活及核桃长势对腐烂病胁迫的响应

冯 雷，耿增超，徐万里，薛泉宏，孙宁川，雇玉忠，唐光木

(1.新疆农业科学院 土壤肥料与农业节水研究所，新疆 乌鲁木齐 830092；2.西北农林科技大学 资源环境学院，陕西 杨凌 712100；3.乌鲁木齐永丰天农农业科技发展有限公司，新疆 乌鲁木齐 830000)

核桃是世界四大干果之一，也是中国主要干果出口品种，主要分布在新疆、河北、陕西等省。腐烂病严重危害核桃生长、发育和繁殖[1]，降低了核桃产量及品质。腐烂病病害程度受寄主抗性、侵染性真菌与外部环境共同影响，但目前对不同腐烂病程度与植株叶片、韧皮部酶活变化和长势作用关系的研究较少。张志华等[2]研究了核桃根与叶中过氧化物酶(POD)活性与长势之间的关系，发现根POD与植株茎粗之间呈显著负相关，周斌等[3]、相昆等[4]分析了冻害与核桃植株抗寒性之间的关系，表明超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、脯氨酸(Pro)等酶参与了低温对核桃的胁迫，而大多数腐烂病的调查研究表明，冻害是腐烂病暴发的重要诱导因素。目前，仍未见腐烂病病害程度与核桃生化代谢之间关系的研究。本研究通过分析4种程度腐烂病与核桃长势(基茎)、POD、Pro、苯丙氨酸转氨酶(PAL)活性，以期为核桃腐烂病侵染程度的预判提供支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验样地位于新疆温宿县核桃林场3队12年生核桃园。2016年4月25日-5月7日，在园区随机选取发病程度为健康(J)、轻度(Q)、中度(Z)和重度(B)病害的核桃树各7株，测定每株基茎，分别在每株的东、南、西、北4个方向各截取3年生枝条，获得枝条混合样品28个；同时在每一方向采集健康叶片5～7片，获得混合叶片样品28袋，样品置于-70 ℃超低温冰箱中待测。

1.2 试验方法

核桃腐烂病发病程度参照Biggs等[5]和孙广宇等[6]在桃和苹果树标准上加以修改。健康：无病疤或 1～2 年生小枝有少量病疤；轻度：2～4年生侧枝有较轻的病疤；中度：主枝上有 1 个病疤，宽度占枝干周长的 50% 以上；重度：主干或主枝上有 3 个病疤，宽度均占枝干周长的50%以上，并测量病斑面积(SCA)。

叶片和韧皮部POD活性的测定参照文献[7]。叶片和韧皮部Pro含量的测定参照张殿忠等[8]的磺基水杨酸法。PAL的提取参照王敬文等[9]所述的方法，材料在-15 ℃冷冻固定，加适量(1∶5，m/V)预冷的硼酸缓冲液<0.2 mol/L，pH值8.8(内含5 mmol/L巯基乙醇)，冰浴匀浆，4层滤纸抽滤得粗提液。粗提液按照Koukol等[10]法检测。

1.3 统计分析

首先，通过Duncan′s单因素方差分析不同病害程度植株叶片和3年生分枝韧皮部POD、Pro、PAL活性的差异显著性。其次，对腐烂病病斑面积、POD、Pro、PAL活性和基茎周长对数标准化，Pearson相关分析检验植株叶片与病斑面积之间的相关性(P< 0.05)，然后将标准化后的病斑面积分别与标准后的叶片POD、Pro、PAL活性和植株基茎进行线性拟合。图中数据是平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 腐烂病发病程度对PAL活性的影响

由图1可知，不同程度腐烂病植株叶片PAL活性差异显著(P< 0.05)。轻度腐烂病植株(Q)叶片PAL活性最高，平均达到6 680.55 U/(g·h)，健康植株(J)叶片PAL活性最低，平均为2 995.83 U/(g·h)，不同病害植株叶片PAL活性排序为：轻度(Q)>中度(Z)>重度(B)>健康(J)。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2，4，5，7，8同。Different lowercase shows a significant difference(P<0.05).The same as Fig.2,4,5,7,8.

如图2，与叶片相比，随着病害程度增加，核桃植株茎PAL活性增加略显缓慢，相同病害程度，轻度腐烂病叶片PAL活性已达到最高值，茎韧皮部PAL活性仅为次高值，病害进一步加强至中度腐烂病PAL活性最高。不同腐烂病程度核桃植株茎韧皮部PAL活性差异显著(P<0.05)，其中，中度腐烂病PAL活性平均为9 069.59 U/(g·h)，是健康植株的3倍，轻度腐烂病的1.3倍，重度腐烂病的1.7倍。图3线性回归分析表明，SCA与PAL活性之间没有明显线性关系(P>0.60)。

图2 不同程度腐烂病核桃植株茎PAL活性比较Fig.2 Comparative with PAL activity of stem at different levels of Jugladis canker

图3 核桃植株病斑面积与叶PAL活性回归分析Fig.3 Linear regression analysis with Jugladis canker area and PAL activity of leaf

2.2 腐烂病发病程度对POD活性的影响

如图4，除中度腐烂病与重度病害叶片POD活性差异不显著(P>0.05)，其他病害程度植株叶片POD活性之间存在显著差异(P<0.05)。其中，健康植株叶片POD活性最高，平均为128.26 U/(g·h)，重度病害叶片POD活性最低，平均为8.29 U/(g·h)，不同病害植株叶片POD活性排序为：健康(J)>轻度(Q)>中度(Z)>重度(B)。

图4 不同程度腐烂病核桃植株叶片POD活性比较Fig.4 Comparative with POD activity of leaf at different levels of Jugladis canker

不同病害程度植株茎韧皮部POD活性有一定差异，其中中度腐烂病茎韧皮部POD活性最高，平均为4.72 U/(g·h)，与健康植株、轻度和重度腐烂病差异显著(P<0.05)。分别是后三者的3.0，1.7，2.0倍，如图5。

由图6可知，SCA与叶片POD活性线性回归方程y=3.66-0.66x，r=-0.76，P<0.001。同时，可看出POD活性<2.4，病斑面积与之呈超显著负相关。由此说明，当叶片POD活性增加，腐烂病病斑面积随之减小。

图5 不同程度腐烂病核桃植株茎POD活性比较Fig.5 Comparative with POD activity of stem at different levels of Jugladis canker

图6 核桃植株病斑面积与叶POD活性回归分析Fig.6 Linear regression analysis with Jugladis canker area and POD activity of leaf

2.3 腐烂病程度对Pro活性的影响

如图7，核桃中度腐烂病植株叶片Pro活性与其他病害程度叶片差异显著，其他腐烂病病害程度叶片间Pro活性差异不显著(P>0.05)。中度腐烂病植株叶片Pro活性最高，平均为308.57 U/(g·h)，是轻度腐烂病植株叶片Pro活性15.7倍。不同病害植株叶片Pro活性排序为：中度(Z)>重度(B)>健康(J)>轻度(Q)。

图7 不同程度腐烂病核桃植株叶片Pro活性比较Fig.7 Comparative with Pro activity of leaf at different levels of Jugladis canker

茎Pro活性与其他组织差异较大，表现为轻度腐烂与健康植株差异显著(P<0.05)，中度腐烂病和重度腐烂病差异显著(P<0.05)；健康植株与中度腐烂病差异不显著(P>0.05)，轻度与重度差异不显著(P>0.05)，如图8。

由图9可知，SCA 与叶片Pro活性线性回归方程：y=0.56x+1.77,r= 0.52，P<0.004。同时，可看出2.4

由表1相关分析可知，SCA与POD活性和植株基茎周长呈极显著负相关，与Pro活性呈极显著正相关(P<0.01)，与PAL活性相关性不显著(P>0.05)。PAL活性与POD活性呈极显著负相关，与Pro活性呈极显著正相关(P<0.01)。表1显示腐烂病致病菌侵染程度受POD、Pro、植株基茎极显著影响，上述因子影响腐烂病致病菌侵染程度的强弱依次是：核桃基茎>POD活性>Pro活性。

图8 不同程度腐烂病核桃植株茎Pro活性比较Fig.8 Comparative with Pro activity of stem at different levels of Jugladis canker

图9 核桃植株病斑面积与叶Pro活性回归分析Fig.9 Linear regression analysis with Jugladis canker area and Pro activity of leaf

表1 腐烂病病斑面积与PAL、POD、Pro、基茎周长的相关性分析(P<0.05)Fig.1 Pearson correlation Jugladis canker with PAL，POD，Pro activity and stem circumference

3 结论与讨论

PAL 是次生代谢物质合成过程中的关键酶，能促使植物体产生次生代谢物质抵抗病原菌的侵染，从而起到抗病作用，被认为是植物的防御酶之一。研究认为 PAL 活性与植物的抗病性呈正相关[11]。而刘佳[12]在研究南瓜时发现，随着病害程度增加，PAL活性降低，并未显示出相关性，且染病比抗病植株活性高。本试验表明，4种病害程度核桃植株叶片和韧皮部PAL活性存在显著差异，与前人研究结果一致[13]。但轻度病害程度核桃植株叶片和中度病害程度茎韧皮部PAL活性分别达到最高，这与前人研究不同，可能是因为叶片对于腐烂病病菌侵染更为敏感，叶片缺少合成PAL前体物质，而茎的韧皮部截留或富集一定量合成PAL前体的物质，如木质素、黄酮、异黄酮、生物碱。另外一方面，植物为抵抗外界生物胁迫，优先将抗性物质输送至病害或者潜在病害处。

POD作为一种植物抗性酶，其活性一定程度可以反映植物的抗病性[14]。陈臻等[15]研究了黄腐酸对苹果腐烂病防御酶POD活性影响，试验结果表明，其活性先上升后降低。但也有研究认为二者没有显著线性或负相关关系：如刘普等[16]认为，梨树腐烂病病害程度与枝条韧皮部POD酶活性无显著关系；张新慧等[17]发现，连作后当归叶片POD酶活性降低。本试验表明，POD酶活性与核桃腐烂病病斑面积呈极显著负相关，这与张新慧等[17]研究结果相同。Pro含量及活性的变化能够表征植物抗逆性。湛蔚等[18]发现，菌根诱导下杨树病害部位Pro含量显著降低，表明病害程度可能与Pro含量存在正相关关系。本试验也发现随着病害程度增加，Pro活性显著提高。

本研究显示，腐烂病与核桃生长势呈极显著负相关，与多数研究结果一致。吴玉霞等[19]研究发现，梨树生长势增强，腐烂病发病率显著降低。樊祥伦[20]通过调查指出：减轻枝干伤疤从而增强树势可以降低病害发生。亦有研究显示：苹果腐烂病发生程度与树势相关[21]。冯雷等[22]研究了核桃腐烂病发病程度与核桃体内元素比例关系，矿质元素P/K<0.28，核桃植株长势更好，未见病菌进一步侵染。李美美等[23]通过修剪方式控制树势，降低了腐烂病发病率。因此说明，增强树势可显著降低植物病害发病程度。

通过分析不同病害程度植株叶片，病害部位抗氧化酶，结果显示，叶片POD和Pro活性均可指示腐烂病侵染过程，叶片POD活性能更好反映核桃腐烂病发生过程。通过增强核桃植株长势可以降低腐烂病侵染程度。