单因素法考察川牛膝多糖提取工艺

赵玥琪，郝婧玮，王镜哲

(牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江牡丹江157012)

川牛膝归属苋科多年生植物川牛膝(Radixcyathulae)的干燥根[1]。研究发现川牛膝中含有多种药用成分，如皂苷类、甾酮类、多糖类、甜菜碱以及多种微量的元素[2-5]。其主要活性成分川牛膝多糖是一种高度分支的多糖，含有D-果糖、D-葡萄糖，可有效抑制肿瘤转移，增强白细胞护肝功能[6-10]，广泛用于机体免疫调节与抗肿瘤治疗。本文采用单因素实验法，比较川牛膝多糖提取过程中，提取方式、提取温度、提取时间、提取料液比对川牛膝多糖得率的影响，用硫酸苯酚显色法与紫外分光光度法进行最优条件筛选，为后期工业化生产产率提升提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药材。川牛膝(四川)。

1.1.2 实验仪器。 紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司，T6新世纪)；台式微量冷冻离心机(贝克曼库尔特，Microfuge 22R)；鼓风干燥箱(上海-恒科学仪器有限公司，DHG-9140A)；分析天平(宽多利斯科学仪器北京有限公司，BSA224S-CW)；智能控温电热套(金坛市荣华仪器制造有限公司，HDM-1000C)；数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，KQ-400DB)；电热恒温水浴锅(上海-恒科技有限公司，HWS28型)。

1.1.3 实验试剂。苯酚(AR)、浓硫酸(AR)、石油醚(AR)、无水葡萄糖(AR)。

1.2 实验方法

1.2.1 川牛膝脱脂除水除杂

称取3份1.0g粉碎后的川牛膝，放置烘箱内，温度调至50℃，烘干至恒重后放于分析天平中称量，通过公式(1-1)计算出川牛膝的含水率，为称取5.0g绝干重提供数据。

M绝干重=M实重×(1-含水率)

(1-1)

称取3份1.0g粉碎后川牛膝，加入20mL石油醚(AR)进行时间为6h的脱脂，放置24h待石油醚挥发后，通过公式(1-2)计算出川牛膝含脂率。

M脱脂重=M实重×(1-含脂率)

(1-2)

对所有粉碎过的川牛膝进行脱脂处理，防止所含脂类影响多糖实验提取测定。

1.2.2 单因素实验。

实验中虽有多个(提取方式时间温度料液比)影响因素，但在安排实验时只考虑一个影响因素，其它因素尽量保持不变的实验，即为单因素实验。

本实验中，提取方式、提取时间、提取温度、料液比各因素间没有交互作用，故可以采用此种方法。

1.2.3 提取方式对提取率的影响

称取绝干重5.0g样品，将样品放入烧杯中加入蒸馏水，分别在超声波震荡器中进行超声波辅助提取和加热套中进行煎煮提取法提取。控制其他因素为：温度50℃，提取时间1h，料液比1∶10。

1.2.4 提取温度对提取率的影响

称取绝干重5.0g样品，分别在温度为20、40、60、80℃条件下采用超声波提取法提取多糖。控制其他因素为：提取时间1h，料液比1∶10。

1.2.5 提取时间对提取率的影响

称取绝干重5.0g样品，温度50℃，料液比1∶10，分别在超声波震荡0.5、1.0、1.5、2.0h进行取样。

1.2.6 提取料液比对提取率的影响

称取绝干重5.0g样品，加入样品与蒸馏水采用超声波提取法进行料液比为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22、1∶25、1∶30的多糖提取。控制其他因素为：提取时间1h，提取温度50℃。

1.2.7 单因素实验处理

将1.2.3、1.2.4、1.2.5、1.2.6实验所得溶液各取2mL，离心机除杂。所得样品，采用苯酚-硫酸法使用紫外分光光度计进行多糖含量测定。

绝干重提取率=(C样品多糖浓度×稀释倍数×V体积)/M绝干重

(1-3)

1.2.8 硫酸苯酚法制作标准曲线制作与测定多糖含量

称取0.05g无水葡萄糖，加蒸馏水定容至500mL，配置为0.1g/L(0.1mg/mL)的葡萄糖标准溶液。各取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加蒸馏水至每组2.0mL，加入5%苯酚溶液[现用现配：取苯酚(AR)0.05g至10mL的棕色容量瓶定容到10mL，放置于超声波震荡器中促使苯酚完全溶解]1.0mL，加入浓硫酸5.0mL，试剂添加完毕震荡5min，室温下静置30min，(提前启动紫外分光光度计预热30min)在波长为490nm进行测量，横坐标X轴指示浓度，纵坐标Y轴指示吸光度，做出标准曲线。

1.2.9 多糖最优条件下水提醇沉

川牛膝多糖最佳醇沉浓度为85%[11]。将最优条件下的提取液，离心除杂后，加入少量无水乙醇，沉降12h后再加入无水乙醇使浓度达到85%，沉降24h后除去不容杂质，放置在恒温水浴锅中，温度设置为60℃，直至蒸干可刮下收集。

本次实验主要研究提取过程中提取方式、温度时间、料液比对提取率的影响，不涉及多糖醇沉的浓度筛选。

2 结果与分析

2.1 川牛膝脱脂除水除杂结果与分析

表1 川牛膝含水率

表2 川牛膝含脂率

由表1和表2可见，川牛膝的含水率为7.97%，含脂率为0.022%，药材转移过程中有损耗，得出结论含脂率不影响脱水率计算，绝干重称取按照含水率计算。每称取5g绝干重的川牛膝药材，根据公式(1-1)需称取原重为5.43g的川牛膝药材。

为防止杂质中极少量脂类影响实验准确度，对所有川牛膝进行脱脂处理，待石油醚全部挥发后继续进行实验。

2.2 单因素实验与多糖含量

2.2.1 标准曲线的制作表

根据葡萄糖标准品浓度0.1mg/mL溶液各浓度吸光度数据做出图1。

图1 苯酚-硫酸法测葡萄糖含量的标准曲线

葡萄糖标准溶液样品在490nm处的吸光度值，以浓度作为横坐标(X)，吸光度值作为纵坐标(Y)绘制葡萄糖含量标准曲线。如图1所示，得到线性回归方程Y=1.2114X-0.0067 R2= 0.9976，在0.00～0.10(0.1mg/mL)范围内线性关系良好。

2.2.2 提取方法的比较

图2 提取方法对提取率的影响

由图2可知在提取温度为50℃、提取时间1h、提取料液比1∶10的情况下，超声波提取法比煎煮法提取率更高，更适合川牛膝多糖的提取，确定后期提取温度提取时间提取料液比时用超声波提取法，相应的实验在超声波振荡器中进行。超声波会产生高速且强烈的空化效应与振动搅拌的作用，可以破坏植物细胞壁，使溶剂快速进入到药材细胞中，加速溶液交换，可缩短提取时间，显著提高提取率。

2.2.3 提取温度的比较

由图3可知在相同超声波辅助、提取时间1h、提取料液比1∶10的情况下，提取温度为60℃时提取率最高为24.6%，温度过低细胞膜通透性较低，提取速度缓慢；温度过高破坏川牛膝药材中的多糖降低了提取率，故最优提取温度为60℃。

图3 提取温度对提取率的影响

2.2.4 提取时间的比较

图4 提取时间对提取率的影响

由图4可知在相同超声波辅助、提取温度50℃、提取料液比1∶10的情况下，提取时间短反应提取不完全，导致提取率较低；提取时间较长时多糖结构遭到破坏提取率低且占用时间长效率低。故提取时间1.5h时提取率最高为25.4%，故最优提取时间是1.5h。

2.2.5 提取料液比的比较

图5 提取料液比对提取率的影响

由图5可知在相同超声波辅助、提取时间1h、提取温度50℃的情况下，料液比过低时，提取出的多糖较少，在1∶20时提取率最高；料液比比例加大提取率降低。故提取料液比1∶20时提取率最高为41.5%，故最优提取料液比为1∶20。

2.3 多糖最优条件下水提醇沉

川牛膝多糖最佳醇沉浓度为85%[11]，将最优条件下的提取液，提取温度60℃提取时间1.5h提取料液比1∶20，离心除杂后，加入少量无水乙醇，沉降12h后再加入无水乙醇使浓度达到85%，沉降24h后除去不容杂质，放置在恒温水浴锅中，温度设置为60℃，直至蒸干可刮下。经过称量最终得率为47.12%。

本次实验主要研究提取过程中提取方式温度时间料液比对提取率的影响，不涉及多糖醇沉的浓度筛选。

3 讨论

3.1 温度对实验的影响

温度影响分子运动，超声波辅助法提取时，超声过程中，在超声波的作用下，温度持续上升，难以下降，实验开始前要严格控制温度，温度稳定后再进行实验。本次实验是单因素实验，实验时需严格控制温度，防止温度偏差导致实验失败。

3.2 醇沉法获取多糖工艺需改进

醇沉过程中，温度不宜控制，随着温度的升高，醇挥发的同时，多糖容易氧化，蒸干程度难以掌握。建议超声波辅助提取法提取完成之后用真空冷冻干燥法进行多糖收集。

3.2.1 提取温度升高提取率下降。多糖是化学成分，随着提取水浴温度的升高，热量不断聚集导致分子运动加剧，更容易进行多糖的提取，多糖得率亦随之增加。而温度达到60℃以上时，随着热量的吸收，川牛膝多糖中某一类糖类化学结构遭到破坏，所以川牛膝多糖提取率下降。提取温度应该设置在川牛膝多糖应提糖类不被破坏的临界温度。

3.2.2 料液比过大过小时提取率低。料液比过低时，体积过小，多糖在提取液中有一定的溶解度，提取液体积过小，导致溶解出的多糖少，因此提取率比较低。料液比过高时，随着多糖的析出，多糖浓度升高，提取液带有极性与浓度差，因此提取液体积过大效果减弱，不能促进多糖的析出。故应选择适当料液比，满足多糖的溶解度，利用浓度差析出更多的川牛膝多糖。

4 结论

4.1 超声波辅助提取法的提取率较煎煮法高出一倍，且超声波清洗仪具加热功能，可降低成本。

4.2 提取温度为60℃时提取率高，多糖不被破坏，且所需反应温度低。

4.3 提取时间为1.5h时提取率最高，耗时中等，反应时间不长，效率高。

4.4 提取料液比为1∶20时提取率最高，提取完成后，要立即浓缩，避免后期收集多糖耗材耗时过多。

4.5 采用超声波辅助提取法、提取温度为60℃、提取时间为1.5h、提取料液比为1∶20时、提取率最高，为47.12%。