基于正相高效液相色谱法的S-奥拉西坦在比格犬体内药代动力学研究

孙文霞， 杨 晨， 荣祖元， 叶 雷， 贺 英， 程 强

(1.成都大学 四川抗菌素工业研究所 药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室， 四川 成都 610052；2.四川省食品药品检验检测院， 四川 成都 611731； 3.重庆东泽医药科技发展有限公司， 重庆 400042)

0 引 言

奥拉西坦(Oxiracetam，ORT)，化学名为4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，能够促进磷酰胆碱和磷酰乙醇胺的合成和脑代谢，并能通过血脑屏障对特异性中枢神经道路起刺激作用，从而改善智力和记忆[1].从ORT的结构式(图1)可见，其在吡咯环上引入了一个羟基，形成一个手性中心，因而存在光学对映体，即S-奥拉西坦(S-ORT)和R-奥拉西坦(R-ORT).相关文献表明，S-ORT对改善动物的学习记忆能力以及认知功能障碍的效果优于ORT.目前，已有学者报道了ORT异构体的分离测定方法以及S-ORT静脉注射后在人体内的转化情况[2-3].对此，本研究建立了正相高效液相色谱法(NP-HPLC)同时测定2种异构体的浓度，并对S-ORT口服给药后的药代动力学等相关情况进行了分析.

图1奥拉西坦的结构式

1 材料与仪器

1.1 材 料

实验所用材料包括：S-ORT对照品(批号，091204-R，含量为100.4%)、R-ORT对照品(批号，20160121，含量为99.86%)，购自成都百途医药科技有限公司；吡拉西坦(批号，100386-200702)，购自中国食品药品检定研究院；甲醇、正己烷均为色谱纯，购自美国Fisher公司；无水乙醇为色谱纯(含量为99.8%)，购自北京百灵威科技有限公司.

实验所用动物包括：比格犬18只，雌雄各半，7～8月龄，体重6～8 kg，四川养麝研究所比格犬繁育中心提供(动物许可证号，SCXK(川)2014-01).实验前，动物检疫和驯化饲养4周.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Sartorius CPA225D型十万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)；TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；XW-80A型涡旋混合器(上海青浦沪西仪器厂)；ZLS-1型真空离心浓缩仪(湖南赫西仪器装备有限公司).

2 方法与结果

2.1 分析方法

2.1.1 色谱条件.

实验的色谱条件为：色谱柱为Daicel CHIRALPAK ID手性分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为正己烷∶乙醇(80∶20)；检测波长为214 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；进样体积为20 μL.

2.1.2 溶液的制备.

分别精密称取S-ORT和R-ORT对照品适量，用50%甲醇配制成含S-ORT和R-ORT均为4 mg/mL的混合对照品储备液，4 ℃下保存，临用时用50%甲醇配制成含R-ORT和S-ORT各为2.00、1.00、0.40、0.20、0.10、0.04、0.02 mg/mL的系列工作对照品溶液.

取内标对照品适量，精密称定，用50%甲醇配成终浓度为1.25 mg/mL的储备液，4 ℃下保存待用.

2.1.3 血浆样品前处理.

取血浆样品200 μL，置1.5 mL具塞离心管中，加入50%甲醇20 μL，内标溶液10 μL，振荡混匀30 s，加入600 μL 甲醇，漩涡振荡1 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液600 μL，置真空离心浓缩仪中50 ℃挥干，残渣用200 μL甲醇复溶，过滤，吸取20 μL进样分析.

2.2 方法验证

2.2.1 专属性.

按“2.1”项下方法，分别测定犬空白血浆、犬空白血浆加S-ORT与R-ORT以及内标对照品、犬口服S-ORT后的血浆样品，其色谱图见图2.结果表明，S-ORT、R-ORT和内标的保留时间分别为14.9、10.7和12.9 min，犬血浆中的内源性物质不干扰3者的测定.

2.2.2 标准曲线及定量限.

取犬空白血浆200 μL，加入ORT对照品系列工作溶液20 μL，配制成相当于S-ORT和R-ORT终浓度分别为2.0、4.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL的模拟血浆样品，不加入50%甲醇，其他步骤按“2.1”项下方法.以待测物S-ORT或R-ORT的浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积比值为纵坐标，经加权(W=1/C)最小二乘法进行回归运算，R-ORT和S-ORT的回归方程分别为，Y=-0.015+0.018C，R=0.995和Y=-0.022+0.018C，R=0.996.

图2 S-ORT、R-ORT和内标的HPLC色谱图

结果表明，两者的线性范围均为2.0～400.0 μg/mL，最低定量限均为2 μg/mL.

2.2.3 精密度与准确度.

取犬空白血浆200 μL，按“2.2.2"项下方法，制成含R-ORT和S-ORT浓度分别为4.0、40.0、200.0 μg/mL 3个浓度的质控(QC)样品，每一浓度做平行6样本分析，连续测定3 d，并根据每批随行标准曲线，计算QC样品中R-ORT和S-ORT的浓度，同时计算批内、批间精密度和准确度，结果见表1.结果表明，R-ORT与S-ORT血浆样品的批内、批间精密度(RSD)均小于15%，方法符合生物样品测定要求.

表1 S-ORT和R-ORT在血浆中的精密度和准确度(n=6)

2.2.4 稳定性.

取犬空白血浆200 μL，按“2.2.2"项下方法，制成含R-ORT和S-ORT浓度分别为4.0，40.0，200.0 μg/mL 3个浓度的QC样品，每一浓度配制3份.分别考察-80 ℃反复冻融3次、室温下放置8 h、-80 ℃下冷冻15 d以及处理后的样品在进样池(5 ℃)中放置24 h后的稳定性.结果表明，3次冻融的回收率为90.14%～107.25%，在室温放置8 h的回收率为91.96%～110.32%，-80 ℃下储存15 d的回收率为90.37%～113.28%，处理后的样品在进样池中(5 ℃)放置24 h的回收率为95.41%～107.83%，RSD小于10.15%.结果表明，方法稳定性良好.

2.3 药代动力学研究

2.3.1 给药及样品采集.

取18只比格犬，随机分为3个剂量组，每组6只，雌雄各半.S-ORT单次灌胃给药，剂量分别为50 mg/kg、150 mg/kg、450 mg/kg，给药前禁食12 h，给药后禁食4 h，自由饮水.自下肢小隐静脉采集给药前及给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、16和24 h血样2.5 mL，置肝素化EP管中，3 000 r/min离心10 min，分离血浆，-80 ℃保存，待测.

2.3.2 药代动力学数据处理.

按“2.1.3"项下方法同时测定各时间点样品中R-ORT和S-ORT的浓度.运用DAS 2.1软件(中国药理学会)计算2者的主要药代动力学参数.结果显示，高、中、低3个剂量组的各个时间点血浆样品中均未检测出R-ORT.此说明，S-ORT经口给药后在犬体内未发生明显的手性转化.低、中、高3种剂量S-ORT灌胃给药后，其在比格犬体内的平均血药浓度随时间变化过程符合一室模型.

S-ORT的血药浓度—时间曲线如图3所示，其主要药动学参数包括，达峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)、半衰期(t1/2)、表面分布容积(V)、消除率(Cl)以及平均血药浓度—时间曲线下面积(AUC(0～24 h))，见表2.

图3 S-ORT在犬体内的平均血药浓度—时间曲线(n=6)

表2 犬口服S-ORT后的药代动力学参数

3 讨论与结论

目前，检测ORT的方法有液质联用法[4-7]和HPLC法[8-9]等，而对ORT异构体进行拆分需采用手性分析柱，并以正己烷、异丙醇及乙醇正相系统等为流动相.若采用液质联用法，由于流动相中没有可以提供质子的化合物或者基团，因而不能采用液质联用电喷雾质谱法(HPLC-ESI-MS)，换用大气压力化学电离源(APCI)则要采用电晕针辅助电离，流动相全是有机相，有着火的危险，因而液质联用法不可行.

在文献[10]中，其采用正己烷∶乙醇∶三氟乙酸(78∶22∶0.1)为流动相，本研究对正己烷、乙醇以及三氟乙酸的比例进行了考察，发现在不加入三氟乙酸，采用正己烷与乙醇的比例为80∶20时，ORT异构体与内标之间的分离度符合要求，且峰形良好.另外，采用甲醇按3∶1的比例处理血浆样品，沉淀后的上清液含有一定比例的水，不能直接进样分析，否则会破坏正相系统，不能正常出峰.因而需要采用氮气吹干用甲醇或流动相复溶后，再进样分析，同时这种方法还可以提高测试灵敏度.

本研究表明，S-ORT口服给药后，低、中、高3个剂量的Tmax分别为1.62±1.15、1.31±0.63、1.80±0.51 h，不随剂量变化；Cmax分别为48.63±14.13、99.57±38.25、184.62±47.63 μg/mL，AUC0-t分别为129.74±42.26、378.13±131.08、872.60±175.321 μg·h/mL，说明Cmax和AUC0-t随剂量增加而增加，呈线性相关性.在各个时间点均未检测到R-ORT，说明S-ORT口服给药后，在犬体内无明显的变旋现象，与人体注射给药的结果一致.