Doxycycline诱导表达Msx2-GFP的鼠晶状体上皮Alpha-TN4细胞株的建立

张娇，于紫燕，赵江月

（中国医科大学附属第四医院眼科，中国医科大学眼科医院，辽宁省晶状体学重点实验室，沈阳 110005）

肌节同源盒基因同系物2（msh homobox 2，Msx2）作为肌节同源框基因家族的一员，其编码的转录抑制蛋白可调控细胞的存活与凋亡［1］。它多表达在间充质细胞与上皮细胞的交界处以及细胞增殖的区域，在体内控制着细胞的增殖和分化，与心血管、骨骼、眼耳鼻等组织发育密切相关，Msx2的表达异常或突变会对机体产生不良影响［2-3］。

在眼发育学研究领域，国外有研究［4］结果显示，在Msx2转基因鼠中发现小眼球畸形及视网膜发育缺陷。先前的研究［5］中也发现Msx2表达异常，通过抑制FoxE3基因并上调Prox1的表达来调控晶状体的发育。同时，敲除Msx2基因可通过激活Casp3/Casp8凋亡信号通路，引起晶状体组织中凋亡增加［6］。晶状体细胞凋亡是导致白内障发生的机制之一，因此，把Msx2作为靶因子导入晶状体上皮细胞，抑制细胞增殖和分化，触发凋亡，可能成为基因治疗晶状体及白内障相关疾病的一个突破性进展。

本研究利用基因开关调节系统（Tet-on），拟建立由doxycycline调控表达的Msx2诱导细胞株，探索其差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），为进一步的临床研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞：实验组选取doxycycline诱导表达Msx2的Alpha-TN4细胞株M8；空载体细胞株T9作为对照。

1.2 细胞培养及诱导

细胞株M8空载体T9在含胎牛血清的细胞培养液（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）过夜培养。经doxycycline（1 μg/mL）处理后，24 h后共聚焦荧光显微镜观察，并收集细胞。

1.3 蛋白提取及浓度测定

培养的细胞用预冷的PBS洗3遍，加入适量（200 μL/60 mm皿）裂解液，细胞刮收取蛋白至EP管每次超声15 s，重复5次，放置30 min，4 ℃离心12 000 r/min，15 min，取上清。考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（北京吉美生物有限公司）测定样本液蛋白浓度。

1.4 二维凝胶电泳

配制CyDye DIGE工作液（400 pmol/μL），根据蛋白定量结果，标本及1份混合内标各取50 μg加入1 μL浓度为400 pmol/μL的CyDye DIGE染料，避光。漩涡震荡，彻底混合，12 000g4 ℃离心10 min，收集底部标记混合物，在黑暗中冰上反应30 min。加入1 μL 10 mmol/L赖氨酸终止标记反应。充分混合，在黑暗中置于冰上10 min。每份样品加入同体积的补充液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、2%DTT、2% IPG Buffer），用再水化液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、18 mmol/L DTT、2% CHAPS、0.5% IPG Buffer）将样品体积补至340 μL，将18 cm IPG胶条（pH 3～pH 10，NL）置于胶条槽内，上样后在IPGphor固相pH梯度等电聚焦仪上行等电聚焦。整个过程避光。灌制12%SDS-PAGE胶，脱氧并保证胶面平齐。将IPG胶条置放在两低荧光玻璃板间的凝胶面上，用0.5%低融点琼脂糖溶液包埋。恒温20 ℃，行SDS-PAGE电泳（15 mA/胶，30 min；30 mA/胶，4 h）。整个过程避光，最后行考马斯亮蓝染色。

1.5 扫描及图像分析

电泳所得凝胶用MilliQ冲洗后用Typhoon 9400荧光扫描仪在不同激发光下扫描成像，所使用波长如 下：Cy2-488/520，Cy3-532/580，Cy5-633/679。所 得的蛋白质组图谱用DeCyder 2-D凝胶图像分析软件进行检测、自动分析，光斑体积的差异作为实验组与对照组蛋白表达水平变化的衡量指标，采用Mann WhitneyU-test进行统计学检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建立由doxycycline诱导稳定表达Msx2的鼠晶状体上皮细胞株

经过扩增培养后，G418筛选出明显由doxycycline调控诱导表达Msx2-GFP的Alpha-TN4细胞株，为M8克隆。同时，以空载体细胞株T9作为阴性对照。细胞株M8在无doxycycline存在的条件下不表达Msx2-GFP，在加入doxycycline（1 μg/mL）10 h后，Msx2-GFP开始有微量表达，随着时间增加，Msx2-GFP的表达量随之增高。细胞株M8和T9在doxycycline（1 μg/mL）处理24 h后，以共聚焦显微镜检测可见细胞株M8有Msx2-GFP明显表达，见图1。

图1 Doxycycline处理24 h后诱导细胞株M8及T9 ×100Fig.1 Induction of M8 and T9 cell lines by a 24-h doxycycline treatment ×100

2.2 二维电泳分析M8及T9细胞株蛋白质

由诱导的细胞株M8和空载体T9阴性对照样品分别获得二维凝胶电泳图谱，每组样品重复3次。经图像分析分别在实验组M8检测到5 460个点，对照组T9检测到5 389个点。其中M8与T9之间差异点有31个，见图2。

图2 二维电泳分析晶状体上皮细胞蛋白质Fig.2 Two-dimensional gel electrophoresis of lens epithelial cell proteins

2.3 RNA微阵列分析和array结果的分析

对M8及T9 2组细胞进行了基因表达微阵列分析。通过SAS统计软件筛选DEGs。结果显示，在Alpha-TN4细胞系中存在712个多于2倍的表达变化的DEGs，其中454个基因被上调，258个基因被下调。在下调的基因中，Col3α1基因下调明显，见图3。对2组细胞进行实时PCR分析，检测到M8组mRNA的相对表达量为7.91±0.35，T9组mRNA的相对表达量为4.08±0.26。Col3α1表达量明显下降，此结果与上述结论保持一致。

图3 M8及T9细胞株DEGsFig.3 Differentially expressed genes in M8 and T9 cells

3 讨论

Msx2是新近发现的参与调控细胞凋亡的关键蛋白。以往研究［7-8］多集中在Msx2对心血管、骨骼等组织发育的影响上，本研究利用基因开关调节系统（Tet-on），首次建立由doxycycline调控表达的Msx2诱导晶状体上皮细胞株。该系统利用改良的大肠杆菌E.coli的调节系统，靶基因的表达受四环素的衍生物doxycyclin精确调节，故具有低毒性、特异性、高敏感性，且不影响细胞内其他基因活性的特点［9］。在诱导细胞株中，Msx2受doxycycline的精确调节，使诱导细胞株建系成功。Msx2诱导细胞株的建立为研究Msx2功能提供了良好的细胞模型。

本研究采用比较蛋白质组学的理论和方法，对诱导细胞株M8和阴性对照细胞株T9蛋白质组进行分析和比较，检测差异明显的蛋白质。经过基因表达微阵列分析，分析出明显下调及上调的基因。并对其中在Msx2过表达细胞株M8中下调明显的Col3α1进行实时PCR分析验证，结果显示，过表达Msx2基因的晶状体上皮细胞与正常细胞相比，Col3α1的表达量明显下降，该结果与基因表达微阵列分析结果保持一致。

Col3α1作为一种Ⅲ型胶原，主要存在于细胞外基质中，尤其在人的血管内膜、肌肉等结缔组织中含量丰富［10］。在晶状体中，胶原纤维的异常增生会加速晶状体上皮细胞纤维化，加速细胞移行，从而导致晶状体浑浊。已知后发性白内障（posterior capsular opacification，PCO）的发生与晶状体囊膜的纤维化和基质的积聚和收缩有关［11］。其中晶状体囊膜由晶状体上皮细胞核纤维产生，富含Ⅳ型胶原蛋白，也含有Ⅰ型和Ⅲ型胶原及细胞外基质成分。研究发现正常情况下Ⅳ型胶原纤维均匀分布于晶状体囊全层，同时还存在Ⅰ型和Ⅲ型胶原，其中Ⅲ型胶原因具有特异性而使晶状体囊区别于眼球内其他基底膜组织［12-13］。而胶原纤维以及细胞外基质的异常沉积是PCO发生的重要病理机制［14］。本研究中Msx2过表达引起的Col3α1下调可能是晶状体上皮细胞发生凋亡的一个潜在机制，这一发现为PCO的基因治疗提供了新的研究思路。但Msx2与Col3α1之间是否存在直接联系，以及Col3α1如何影响Msx2，从而促发细胞凋亡，仍需进一步研究。