食管鳞癌中TOP2A蛋白的表达与临床预后的关系

李宾 王忠民 陈志军 董成来 曹克鑫 甘绍印 陶义鹏

新乡医学院第一附属医院胸外一科（河南新乡 453100）

食管癌的发病率、死亡率已经位居我国的第五位、第四位[1]，手术仍然是食管癌的首选治疗方法，而中晚期食管癌患者术后的5年生存率却仅为30%[2]。研究发现，同一基因不同的表达水平和（或）不同基因的表达都使食管癌在生物学特性上面发生改变[3]。目前已经证实，TOP2A基因位于17q12-21，它编码的人类拓扑异构酶Ⅱα（topoismeraseⅡalpha，TOPⅡα），是一种依赖ATP的水解酶和合成酶，在细胞多种生物学行为中起着重要作用，包括DNA复制、染色体分离、染色质浓缩及基因表达等[4]。目前已经证实，它的异常表达与非小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌等多种实体肿瘤密切相关，且均促进了肿瘤组织的增殖、转移[5-7]。但关于TOP2A在食管癌中的表达情况鲜有报道，因此，探索TOP2A在食管鳞癌中的表达情况，以及其与食管癌患者的临床预后情况，具有非常重要的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2010年9月至2013年7月新乡医学院第一附属医院胸外科行“食管癌根治术”手术切除的蜡块组织标本126例，将双源癌、已接受术前放化疗的患者剔除，共28例，观察入组98例患者建立资料库，同时选取55例癌旁组织（距癌组织切缘＞5 cm）作为对照组，所选取术后组织标本均经我院病理科2位专家检查确诊为鳞癌，按照AJCC及UICC联合制订的恶性肿瘤TNM分期（第8版）食管癌分期标准对标本进行TNM分期。从性别、年龄、肿瘤位置、病变长度、分化程度、淋巴结转移及临床分期等7个特征进行分析。

1.2 患者随访查阅我院病案室患者的相关资料，根据入院病历基本信息及联系方式，主要通过电话和门诊随访进行随访。其中，联系方式发生变化的，根据病历地址入户随访，更新联系方式后继续电话随访。随访频率为每半年一次，直到终末事件（死亡）为止。本研究随访起止时间为2016年3月，截止时间为2018年5月，共获取有明确生存状况的患者92例，随访成功率为94%。生存日期以手术日期到随访日期确定为准。

1.3 主要试剂兔抗人TOP2A单克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司，即用型SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 实验方法采用免疫组织化学法检测TOP2A蛋白在食管鳞癌中的表达，具体如下：将组织标本从固定液中取出，常规脱水，石蜡包埋，4 μm连续切片，制备成石蜡切片，按SP试剂盒说明书进行免疫组化染色，一抗工作液浓度以1∶200稀释（即将TOP2A原液稀释200倍备用），用0.1 mmol/L的PBS液代替TOP2A一抗作为阴性对照。DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，脱水透明后，树胶封片，显微镜下观察结果。

1.5 结果判读以细胞中出现明显的棕黄色颗粒为阳性表达。TOP2A阳性信号定位于细胞质中。根据临床病理学免疫组化判定标准，细胞阳性及其程度由细胞率和细胞染色强度共同决定[8]。视野标准：每个视野不低于200个细胞。随机性的对5个视野进行观察，判定标准：无着色为0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；肿瘤细胞显色程度：＜10%定为0分，10%～25%为1分，26% ～50%为2分，＞50%为3分；二者总积分0～3分为阴性，4～5分为（+），6～7分为（++），8分以上为（+++），其中阳性表达是+～+++。

1.6 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析，计数资料分析使用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meie（K-M）法绘制生存曲线并计算生存率，采用Log-rank检验进行单因素分析，采用COX回归模型进行多因素分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TOP2A蛋白在食管鳞癌和癌旁组织中的表达情况食管鳞癌组织中TOP2A蛋白表达阳性率为47.9%（47/98），在正常食管黏膜组织中表达阳性率为23.6%（13/55）。癌组织中TOP2A表达高于癌旁组织（χ2=12.085，P=0.001），差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表1。

图1 TOP2A在食管癌及癌旁组织中的表达（100×）Fig.1 Expression of TOP2A in esophageal carcinoma and paracancerous tissues

表1 TOP2A在食管鳞癌和癌旁组织中的表达Tab.1 Expression of TOP2A in esophageal squamous cellcarcinoma and paracancerous tissue 例（%）

2.2 TOP2A的表达与食管癌临床病理特征关系采用行×列表卡方检验进行统计学分析，结果显示：性别、年龄、肿瘤位置与TOP2A的表达不具有相关性，差异不具有统计学意义（χ2=0.334、1.142、1.134，P＞ 0.05）；而病变长度、分化程度、淋巴结转移及临床分期与TOP2A的表达具有相关性，差异有统计学意义（χ2=4.833、8.942、5.749、9.343；P＜0.05）。见表2。

2.3 TOP2A表达与预后的关系对98例食管鳞癌患者进行回顾性分析，采用Kaplan-Meie（K-M）法计算生存率，并用Log-rank检验进行单因素分析。TOP2A表达阳性患者的5年生存率为19%，而TOP2A表达阴性患者的5年生存率为25%；本研究显示：性别、年龄及肿瘤位置对食管癌患者的临床预后无显著影响；而病变长度、分化程度、淋巴转移、临床分期及TOP2A表达均可以对食管癌患者的生存率产生显著的影响（P＜0.05，表3）。进一步将相关变量纳入COX回归模型，进行多因素分析，结果显示，病变长度不是影响患者预后的危险因素；而分化程度、淋巴转移、临床分期及TOP2A表达均是影响患者预后的危险因素（P＜0.05）。TOP2A表达情况对生存率的影响差异有统计学意义（P=0.014），是影响食管癌患者预后的独立危险因素。即TOP2A阳性表达的比阴性表达的风险高1.124倍。见表4。

表2 113例食管癌临床病理特征与TOP2A的表达与关系Tab.2 Relationship between clinicopathological features and expression of TOP2A in 113 cases of esophageal cancer例

表3 食管癌患者预后单因素分析Tab.3 Univariate analysis of prognosis in patients with esophageal cancer

3 讨论

食管癌的病因尚未完全明了，有研究指出，其与原癌基因的激活、抑癌基因的失活、调节DNA的修复等分子生物学行为密切相关。TOP2A编码的DNA拓扑异构酶Ⅱ蛋白（TOPⅡ）是一种基本的核酶，可以催化DNA双链超螺旋结构发生断裂和连接反应，并与细胞分裂、有丝分裂期染色体配对、染色体分离、基因重组和转录及DNA损伤与修复有密切关系。TOP2A在食管癌、肝癌、胃癌及大肠癌等多种实体肿瘤中的表达明显高于相邻的正常组织，且其表达水平与肿瘤的增殖水平呈现正相关性[9-11]。另有研究表明，肿瘤中高表达的TOP2A与腋窝淋巴结转移和远处转移等恶性生物学行为密切相关[12]。

表4 食管癌患者预后多因素COX分析Tab.4 COX analysis of prognostic factors in patients with esophageal cancer

本研究采用免疫组织化学（SP）染色检测了TOP2A的蛋白在食管鳞癌中表达情况，得出了类似的结论。本研究发现TOP2A在食管癌组织中的蛋白表达明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，还发现在有淋巴转移的食管癌组织中，TOP2A蛋白的阳性率为56.8%，而无淋巴转移的食管癌组织中TOP2A的阳性率仅为33.3%。在对98例食管癌患者的病理特征分析中发现，TOP2A的表达水平与性别、年龄无明显相关性；而与浸润深度、分化程度、淋巴转移及临床分期有明显的相关性。外膜浸润、低分化、淋巴转移及较晚的临床分期等均提示肿瘤具有更大、更强的恶性生物学行为，而TOP2A在这些病理特征中呈现的更高表达，提示着TOP2A有望在临床上成为预测肿瘤预后的一个生物学指标。

食管癌的预后相关因素较多，目前大多研究认为组织学类型、分化程度、病变长度、浸润深度及肿瘤位置等与肿瘤的临床预后密切相关[13-16]；TAKEMURA等[17]的研究发现患者的浸润深度、淋巴结转移、病理分期、脉管转移是独立的预后因素。本研究对92例食管癌的预后相关因素进行分析，对其结果进行统计学分析，结果显示，TOP2A表达、病变长度、分化程度、淋巴转移及临床分期均对食管癌患者的5年生存率产生显著的影响。本研究进一步将TOP2A表达、病变长度、分化程度、淋巴转移及临床分期纳入COX风险比例模型，结果显示TOP2A表达、分化程度、淋巴转移及临床分期是影响食管癌患者远期预后的独立危险因素，在患者远期预后评估中有重要的临床意义。

综上所述，TOP2A在食管癌组织中的蛋白表达明显高于癌旁组织，且它的高表达与病变长度、分化程度、淋巴转移及临床分期等病理特征密切相关，这为其成为预测肿瘤预后的生物学指标提供了实验依据。而对92例患者5年生存情况进行回顾性分析，将TOP2A表达、病变长度、分化程度、淋巴转移及临床分期等变量因素纳入COX风险比例模型，结果显示TOP2A表达阳性的患者比阴性患者的风险高1.124倍，这为TOP2A成为预测肿瘤预后的生物学指标提供了临床依据。即通过对TOP2A表达情况的分析，可判定患者的临床预后。同时，本研究存在一定的局限性，对于TOP2A在淋巴结中的表达情况，它的高表达是否促进了淋巴结的转移及不同区域转移淋巴结的表达强度等问题还需进一步深入的研究。