糙叶五加花化学成分及其抗炎活性

李小军， 吴贤哲， 金伦喆*， 刘向前

（1. 湖南中医药大学药学院， 湖南 长沙410208； 2. 圆光大学药学院， 韩国 益山54538； 3. 赣南医学院药学院， 江西 赣州341000）

糙叶五加Acanthopanax henryi （Oliv.） Harms 为中国特有的五加科五加属植物, 广泛分布于湖南、甘肃、 四川等地。 湖南省中药材地方标准收载的“五加皮” 就是以该植物的根皮入药, 具有祛风湿、 活血化瘀、 壮筋骨等功效, 主要用于治疗风湿痹痛、 拘挛麻木、 筋骨痞软、 水肿、 跌打损伤、 疝气腹痛等[1]。 国内外学者对五加属植物的研究多集中在《中国药典》 收载的细柱五加、 刺五加。对糙叶五加的研究也多集中于其叶[2-5], 对其花的研究鲜有报道。 课题组首次在抗炎活性导向下对糙叶五加花进行成分研究, 从乙酸乙酯萃取部位中分离鉴定出17 个化合物, 所有化合物均为首次从糙叶五加花中分离得到。

1 仪器与材料

JEOL JNM ECP-400 核磁共振仪（日本电子株式会社）； Q-TOF micro LC-MS/MS 质谱仪（美国Waters 公司）； 高相液相色谱仪为YL9100 HPLC 系统（韩国英麟公司）； Kieselgel 60 F254和RP-18 F254s（德国默克公司）。 Dulbecco’s modified Eagle’s medium （DMEM）、 胎 牛 血 清 （FBS） （美 国Grand Island 公司）； 脂多糖（LPS）、 3- （4, 5-二甲基噻唑-2） -2, 5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、 Griess （美国Sigma-Aldrich公司）。 阳性对照紫铆因为韩国圆光大学药学院生药及天然产物研究室自制（含有量≥98.5%）。 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 和小鼠小胶质细胞BV2 来源于韩国圆光大学Park Hyun 教授实验室。

样品于2017 年8 月采自湖南省新化, 经湖南中医药大学药学院刘向前教授鉴定为五加科五加属植物糙叶五加Acanthopanax henryi （Oliv.） Harms 的花, 标本保存于湖南省重点实验室中药新药研究与开发实验室, 标本号AH201708-04。

2 提取与分离

干燥的糙叶五加花5 kg, 粉碎至粗粉, 以70%甲醇回流提取3 次, 合并提取液, 浓缩后得总浸膏。 总浸膏加入适量蒸馏水分散后依次用石油醚、乙酸乙酯、 正丁醇进行萃取。 回收溶剂, 得石油醚萃取物（40 g）、 乙酸乙酯萃取物（60 g）、 正丁醇萃取物（42 g）。 乙酸乙酯部位分别经反相、 正相硅胶反复柱色谱分离, 分别以甲醇-水、 氯仿-甲醇-水梯度洗脱, 再经Sephadex LH-20 柱 （氯仿-甲醇）、 制备薄层及HPLC [甲醇-水（0.1%甲酸） ]得化合物1 （21 mg）、 2 （41 mg）、 3 （6 mg）、 4（24 mg）、 5 （15 mg）、 6 （48 mg）、 7 （54 mg）、 8（5 mg）、 9 （5 mg）、 10 （6 mg）、 11 （22 mg）、 12（18 mg）、 13 （14 mg）、 14 （4 mg）、 15 （12 mg）、16 （8 mg）、 17 （3 mg）。

3 结构鉴定

化合物1： 黄色粉末 （甲醇）, ESI-MS m/z：487 [M + Na]+。1H-NMR （CD3OD, 400 MHz） δ：7.71 （1H, d, J=2.0 Hz, H-2′）, 7.56 （1H, dd,J=8.4, 2.0 Hz, H-6′）, 6.85 （1H, d, J=8.4 Hz,H-5′）, 6.32 （1H, d, J=1.6 Hz, H-8）,6.14 （1H,d, J=2.0 Hz, H-6）,5.23 （1H, d, J=7.6 Hz, glc-H-1″）, 3.86 ～3.23 （6H, m, H-2″～6″）；13C-NMR（CD3OD, 100 MHz） δ： 157.0 （C-2）, 134.4 （C-3）, 178.0 （C-4）, 161.6 （C-5）, 98.6 （C-6）,164.6 （C-7）, 93.5 （C-8）, 157.7 （C-9）, 104.3（C-10）, 121.7 （C-1′）, 114.7 （C-2′）, 144.5 （C-3′）, 148.5 （C-4′）, 116.3 （C-5′）, 121.9 （C-6′）,103.2 （glc-C-1″）,74.4 （C-2″）,76.8 （C-3″）,69.9（C-4″）,77.0 （C-5″）,61.2 （C-6″）。 以上数据与文献[6] 一致, 故鉴定为槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物2： 黄色粉末 （甲醇）, ESI-MS m/z：471 [M + Na]+。1H-NMR （CD3OD, 400 MHz） δ：8.05 （2H, d, J=9.2 Hz, H-2′,6′）,6.88 （2H, d,J=9.2 Hz,H-3′,5′）,6.38 （1H,d,J=2.0 Hz,H-8）, 6.19 （1H, d, J=2.0 Hz, H-6）,5.24 （1H, d,J=7.6 Hz, glc-H-1″）, 3.70 ～3.40 （6H, m, H-2″～6″）；13C-NMR （CD3OD, 100 MHz） δ： 157.2 （C-2）, 134.2 （C-3）, 178.2 （C-4）, 161.7 （C-5）,98.6 （C-6）, 164.6 （C-7）,93.5 （C-8）,157.7 （C-9）, 104.4 （C-10）, 121.5 （C-1′）, 131.0 （C-2′,6′）, 114.8 （C-3′, 5′）, 160.2 （C-4′）, 102.9 （glc-C-1″）, 74.4 （C-2″）, 76.7 （C-3″）, 70.0 （C-4″）,77.1 （C-5″）, 61.3 （C-6″）。 以上数据与文献[7-8] 一致, 故鉴定为山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物3： 黄色粉末 （甲醇）, ESI-MS m/z：455 [M + Na]+。1H-NMR （CD3OD, 400 MHz） δ：8.05 （2H, d, J=9.2 Hz, H-2′,6′）,6.88 （2H, d,J=9.2 Hz,H-3′,5′）,6.38 （1H,d,J=2.0 Hz,H-8）, 6.19 （1H, d, J=2.0 Hz, H-6）,5.37 （1H, d,J=2.0 Hz, rha-H-1″）, 3.83-3.69 （4H, m, H-2″～5″）, 0.92 （3H, d, J= 6.0 Hz, H-6″, rha-CH3）；13C-NMR （CD3OD, 100 MHz） δ： 157.2 （C-2）,134.9 （C-3）, 178.3 （C-4）, 161.9 （C-5）, 98.5（C-6）, 164.5 （C-7）, 93.4 （C-8）, 158.0 （C-9）,104.6 （C-10）, 121.3 （C-1′）, 130.6 （C-2′, 6′）,115.2 （C-3′, 5′）, 160.2 （C-4′）, 102.2 （rha-C-1″）, 70.7 （C-2″）, 70.8 （C-3″）, 71.9 （C-4″）,70.6 （C-5″）, 16.3 （C-6″, rha-CH3）。 以上数据与文献[8] 一致, 故鉴定为山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物4： 黄色粉末 （甲醇）, ESI-MS m/z：617 [M + Na]+。1H-NMR （CD3OD, 400 MHz） δ：8.06 （2H, d, J=9.2 Hz, H-2′,6′）,6.89 （2H, d,J=9.2 Hz,H-3′,5′）,6.41 （1H,d,J=2.0 Hz,H-8）, 6.21 （1H, d, J=2.0 Hz, H-6）,5.10 （1H, d,J=7.6 Hz, glc-H-1″）, 4.50 （1H, d, J=1.2 Hz,rha-H-1‴）, 3.81 （1H, dd, J=11.0, 1.2 Hz, H-6″a）, 3.63 （1H, m, H-6″b）, 3.70 ～3.20 （8H, m,glc-H-2″～5″, rha-H-2‴～5‴）, 1.12 （3H, d, J=6.0 Hz, H-6‴, rha-CH3）；13C-NMR （CD3OD, 100 MHz）δ： 157.2 （C-2）, 134.2 （C-3）, 178.0 （C-4）,161.6 （C-5）, 98.7 （C-6）,164.7 （C-7）,93.7 （C-8）, 158.2 （C-9）, 104.4 （C-10）, 121.4 （C-1′）,131.1 （C-2′, 6′）, 114.9 （C-3′, 5′）, 160.2 （C-4′）,103.4 （glc-C-1″）,74.4 （C-2″）,75.9 （C-3″）,70.2 （C-4″）, 76.8 （C-5″）, 67.3 （C-6″）, 101.1（rha-C-1‴）, 70.8 （C-2‴）, 71.0 （C-3‴）, 72.6 （C-4‴）,68.4 （C-5‴）,16.6 （C-6‴,rha-CH3）。 以上数据与文献 [9] 一致, 故鉴定为山柰酚-3-芸香糖苷。

化合物5： 黄色粉末 （甲醇）； ESI-MS m/z：539 [M + Na]+。1H-NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：7.50 （1H, d, J=16.0 Hz, H-7″）, 7.38 （1H, d,J=16.0 Hz, H-7′）, 7.03 （2H, brs, H-2′, 2″）,6.94 （2H, t, J=8.0 Hz, H-6′, 6″）, 6.73 （2H, t,J=8.0 Hz, H-5′, H-5″）, 6.23 （1H, d, J=16.0 Hz, H-8″）,6.20 （1H, d, J=16.4 Hz, H-8′）,5.18（1H, d, J=10.8 Hz, H-5）,3.68 （1H, brs, H-3）,3.65 （1H, brs, H-4）, 2.25 （1H, t, J=12.0 Hz,H-6a）, 1.98 （3H, m, H-2a, 2b, 6b）；13C-NMR（DMSO-d6, 100 MHz） δ： 174.2 （C-7）, 166.4 （C-9″）, 165.7 （C-9′）, 148.9 （C-4″）, 148.6 （C-4′）,146.3 （C-3″）,146.2 （C-3′）,145.3 （C-7″）,144.3（C-7′）, 126.3 （C-1″）, 126.1 （C-1′）, 121.6 （C-6″）, 121.0 （C-6′）, 116.3 （C-5″）, 116.3 （C-5′）,115.5 （C-2″）,115.4 （C-2′）,115.1 （C-8″）,116.2（C-8′）, 83.1 （C-1）, 71.4 （C-4）, 69.3 （C-3）,70.1 （C-5）, 40.0 （C-2）, 34.0 （C-6）。 以上数据与文献[10-11] 一致, 故鉴定为1, 5-双咖啡酰奎宁酸。

化合物6： 黄色粉末 （甲醇）； ESI-MS m/z：539 [M + Na]+。1H-NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：7.50 （2H, d, J=15.6 Hz, H-7′, 7″）, 7.02 （2H,m, H-2′, 2″）, 6.95 （2H, m, H-6′, 6″）, 6.75（2H, m, H-5′, H-5″）, 6.24 （2H, d, J=15.6 Hz,H-8′, 8″）, 5.55 （1H, brs, H-3）, 4.98 （1H, brs,H-4）, 4.24 （1H, brs, H-5）, 2.15 （3H, m, H-6a,6b,2a）,1.87 （1H, brs, H-2b）；13C-NMR （DMSOd6, 100 MHz） δ： 177.6 （C-7）, 166.8 （C-9″）,166.6 （C-9′）,149.2 （C-4″）,149.2 （C-4′）,146.2（C-3″）, 146.2 （C-3′）, 146.1 （C-7″）, 146.1 （C-7′）, 126.1 （C-1″）, 125.8 （C-1′）, 122.0 （C-6″）,122.0 （C-6′）,116.4 （C-5″）,116.4 （C-5′）,115.4（C-2″）, 115.4 （C-2′）, 114.2 （C-8″）, 114.2 （C-8′）, 76.8 （C-1）, 76.1 （C-4）, 68.4 （C-3）, 69.1（C-5）,40.2 （C-2）,38.3 （C-6）。 以上数据与文献[10, 12] 一致, 故鉴定为1, 4-双咖啡酰奎宁酸。

化合物7： 黄色粉末 （甲醇）； ESI-MS m/z：539 [M + Na]+。1H-NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：7.49 （1H, d, J=15.6 Hz, H-7″）, 7.40 （1H, d,J=15.6 Hz, H-7′）, 7.05 （1H, brs, H-2″）, 7.01（1H, brs, H-2′）,6.94 （1H, d, J=8.0 Hz, H-6″）,6.90 （1H, d, J=8.0 Hz, H-6′）, 6.74 （2H, brs,H-5″, H-5′）, 6.25 （1H, d, J= 15.6 Hz, H-8″）,6.18 （1H, d, J=16.0 Hz, H-8′）, 5.28 （1H, brs,H-3）, 4.01 （1H, brs, H-5）, 3.54 （1H, d, J=8.4 Hz, H-4）,2.58 （1H,m,H-6a）,2.38 （1H,m,H-2a）, 2.19 （1H, m, H-6b）, 1.81 （1H, m, H-2b）；13C-NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ： 175.8 （C-7）,166.9 （C-9″）,165.6 （C-9′）,149.9 （C-4″）,149.1（C-4′）, 146.6 （C-3″）, 146.5 （C-3′）, 145.5 （C-7″）, 144.3 （C-7′）, 126.1 （C-1″）, 125.6 （C-1′）,121.9 （C-6″）,121.2 （C-6′）,116.5 （C-5″）,116.5（C-5′）, 115.3 （C-2″）, 115.2 （C-2′）, 116.5 （C-8′）, 114.7 （C-8″）,82.4 （C-1）,73.2 （C-4）,70.9（C-3）, 69.6 （C-5）, 38.3 （C-2）, 35.3 （C-6）。 以上数据与文献[10-11] 一致, 故鉴定为1, 3-双咖啡酰奎宁酸。

化合物8： 黄色粉末 （甲醇）； ESI-MS m/z：539 [M + Na]+。1H-NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：7.50 （1H, d, J=16.0 Hz, H-7″）, 7.40 （1H, d,J=16.0 Hz, H-7′）, 7.03 （2H, brs, H-2′, 2″）,6.94 （2H, dd, J=8.0, 2.0 Hz, H-6′, 6″）, 6.73（2H, d, J=8.0 Hz, H-5′, H-5″）, 6.23 （1H, d,J=16.0 Hz, H-8″）, 6.20 （1H, d, J=16.0 Hz, H-8′）, 5.40 （1H, m, H-5）, 4.91 （1H, m, H-4）,4.07 （1H, m, H-3）, 2.20-1.90 （4H, m, H-2, H-6）；13C-NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ： 175.5 （C-7）, 165.7 （C-9′）, 165.6 （C-9″）, 148.3 （C-4′）,148.2 （C-4″）,145.2 （C-3′）,145.0 （C-3″）,145.3（C-7′）, 145.3 （C-7″）, 125.3 （C-1′）, 125.2 （C-1″）, 121.3 （C-6′）, 121.2 （C-6″）, 115.4 （C-5′）,115.4 （C-5″）,114.4 （C-2′）,114.5 （C-2″）,114.0（C-8′）, 114.1 （C-8″）, 73.2 （C-1）, 72.4 （C-4）,68.0 （C-3）, 64.0 （C-5）, 39.7 （C-6）, 35.4 （C-2）。 以上数据与文献[13-14] 一致, 故鉴定为4,5-双咖啡酰奎宁酸。

化合物9： 黄色粉末 （甲醇）； ESI-MS m/z：539 [M + Na]+。1H-NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：7.45 （1H, d, J=16.0 Hz, H-7′）, 7.42 （1H, d,J=16.0 Hz, H-7″）, 7.01 （2H, brs, H-2′, 2″）,6.94 （2H, dd, J=8.0, 1.6 Hz, H-6′, 6″）, 6.74（1H, d, J=8.0 Hz, H-5′）, 6.72 （1H, d, J=8.0 Hz, H-5″）,6.21 （1H, d, J=16.0 Hz, H-8′）,6.16（1H, d, J=16.0 Hz, H-8″）, 5.52 （1H, m, H-3）,4.88 （1H, m, H-4）, 4.15 （1H, brs, H-5）, 2.11-1.71 （4H, m, H-2, H-6）；13C-NMR （DMSO-d6,100 MHz） δ： 177.5 （C-7）, 168.0 （C-9′）, 168.0（C-9″）, 150.1 （C-4′）, 150.1 （C-4″）, 147.2 （C-3′）, 147.2 （C-3″）, 147.3 （C-7′）, 147.2 （C-7″）,127.2 （C-1′）,127.2 （C-1″）,123.4 （C-6′）,123.4（C-6″）, 117.5 （C-5′）, 117.5 （C-5″）, 116.3 （C-2′）, 116.3 （C-2″）, 115.6 （C-8′）, 115.6 （C-8″）,77.7 （C-1）, 77.0 （C-4）, 70.5 （C-5）, 70.1 （C-3）, 40.6 （C-2）, 39.5 （C-6）。 以上数据与文献[13-14] 一致, 故鉴定为3, 4-双咖啡酰奎宁酸。

化合物10： 黄色粉末（甲醇）； ESI-MS m/z：539 [M + Na]+。1H-NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：7.50 （1H, d, J=16.0 Hz, H-7″）, 7.46 （1H, d,J=16.0 Hz, H-7′）, 7.10 （1H, d, J=1.6 Hz, H-2″）, 7.08 （1H, d, J=1.6 Hz, H-2′）, 7.02 （2H,dd, J=8.0, 1.6 Hz, H-6′, 6″）, 6.83 （1H, d, J=8.0 Hz, H-5″）, 6.80 （1H, d, J=8.0 Hz, H-5′）,6.29 （1H, d, J=16.0 Hz, H-8″）, 6.20 （1H, d,J=16.0 Hz, H-8′）, 5.22 （1H, m, H-3）, 5.15（1H, brs, H-5）, 3.85 （1H, m, H-4）, 2.20 ～1.97（4H, m, H-2, H-6）；13C-NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ： 175.5 （C-7）, 166.6 （C-9″）, 166.0 （C-9′）, 148.4 （C-4″）, 148.3 （C-4′）, 145.6 （C-3″）,145.2 （C-3′）,145.7 （C-7″）,145.7 （C-7′）,125.9（C-1″）, 125.8 （C-1′）, 122.0 （C-6″）, 121.8 （C-6′）, 116.2 （C-5″）, 116.1 （C-5′）, 114.8 （C-2″）,114.5 （C-2′）, 115.1 （C-8″）, 115.0 （C-8′）, 72.8（C-1）, 71.2 （C-3）, 71.2 （C-5）, 71.0 （C-4）,36.1 （C-2）, 35.0 （C-6）。 以上数据与文献[13-14] 一致, 故鉴定为3, 5-双咖啡酰奎宁酸。

化合物11： 黄色粉末（甲醇）, ESI-MS m/z：309 [M + Na]+。1H-NMR （CD3OD, 400 MHz） δ：8.05 （2H, d, J=9.2 Hz, H-2′,6′）,6.88 （2H, d,J=9.2 Hz,H-3′,5′）,6.38 （1H,d,J=2.0 Hz,H-8）, 6.19 （1H, d, J = 2.0 Hz, H-6）；13C-NMR（CD3OD, 100 MHz） δ： 157.2 （C-2）, 134.2 （C-3）, 178.2 （C-4）, 161.7 （C-5）, 98.6 （C-6）,164.6 （C-7）, 93.5 （C-8）, 157.8 （C-9）, 104.4（C-10）, 121.5 （C-1′）, 131.0 （C-2′, 6′）, 114.8（C-3′, 5′）, 160.2 （C-4′）。 以上数据与文献[8]一致, 故鉴定为山柰酚。

化 合 物 12： 黄 色 粉 末 （ 甲 醇）。1H-NMR（CD3OD, 400 MHz） δ： 7.66 （1H, d, J=2.0 Hz,H-2′）, 7.61 （1H, dd, J = 8.4, 2.0 Hz, H-6′）,6.85 （1H, d, J=8.4 Hz, H-5′）,6.38 （1H, d, J=2.4 Hz, H-8）, 6.19 （1H, d, J=2.0 Hz, H-6）,5.10 （1H, d, J=7.6 Hz, glc-H-1″）, 4.51 （1H, d,J=1.6 Hz, rha-H-1‴）, 3.81 （1H, dd, J= 11.0,1.2 Hz, H-6″a）, 3.63 （1H, m, H-6″b）, 3.55-3.24（8H, m, glc-H-2″～5″, rha-H-2‴～5‴）, 1.12 （3H,d, J=6.0 Hz, H-6‴, rha-CH3）；13C-NMR （CD3OD,100 MHz） δ： 157.2 （C-2）, 134.3 （C-3）, 178.1（C-4）, 161.6 （C-5）, 98.7 （C-6）, 164.8 （C-7）,93.6 （C-8）, 158.0 （C-9）, 104.3 （C-10）, 121.8（C-1′）, 114.7 （C-2′）, 144.5 （C-3′）, 148.5 （C-4′）, 116.4 （C-5′）, 122.2 （C-6′）, 103.4 （glc-C-1″）, 74.4 （C-2″）, 75.9 （C-3″）, 70.1 （C-4″）,76.9 （C-5″）, 67.2 （C-6″）, 101.1 （rha-C-1‴）,70.8 （C-2‴）, 70.9 （C-3‴）, 72.6 （C-4‴）, 68.4（C-5‴）, 16.6 （C-6‴, rha-CH3）。 以上数据与文献[9] 一致, 故鉴定为芦丁。

化合物13： 白色粉末（甲醇）； ESI-MS m/z：541 [M + Na]+。1H-NMR （400 MHz, DMSO-d6） δ：6.89 （1H, d, J=1.8 Hz, H-2′）,6.79 （1H, d, J=8.4 Hz, H-5′）,6.68 （1H, dd, J=1.8,8.4 Hz, H-6′）, 2.37 （1H, m, H-7′a）, 2.85 （1H, dd, J=13.2, 4.8 Hz, H-7′b）,2.59 （1H, m, H-8′）,3.89（1H, dd, J=8.4, 6.6 Hz, H-9′a）, 3.56 （1H, m,H-9′b）, 6.84 （1H, d, J = 1.8 Hz, H-2）, 6.78（1H, d, J=8.4 Hz, H-5）, 6.78 （1H, dd, J=1.8,8.4 Hz, H-6）, 4.68 （1H, d, J= 6.7 Hz, H-7）,2.28 （1H, m, H-8）, 3.62 （1H, m, H-9a）, 3.80（1H, dd, J=6.6, 10.8 Hz, H-9b）, 4.17 （1H, d,J= 7.8 Hz, H-1″）, 2.98 （1H, m, H-2″）, 3.13（1H, m, H-3″）, 3.06 （1H, m, H-4″）, 3.09 （1H,m, H-5″）, 3.42 （1H, m, H-6″a）, 3.66 （1H, m,H-6″b）, 5.98 （2H, d, J=2.4 Hz, -OCH2O-）,5.96（2H, s, -OCH2O-）, 5.15, 4.98, 4.94, 4.52 （each 1H, brs, 2″, 3″, 4″, 6″-OH）；13C-NMR （DMSO-d6,100 MHz） δ： 137.9 （C-1）, 108.6 （C-2）, 147.8（C-3）, 146.9 （C-4）, 108.4 （C-5）, 119.7 （C-6）,81.8 （C-7）, 50.8 （C-8）, 66.7 （C-9）, 101.4 （C-10, -OCH2O-）, 135.3 （C-1′）, 106.9 （C-2′）,147.8 （C-3′）,145.9 （C-4′）,109.7 （C-5′）,122.2（C-6′）, 32.8 （C-7′）, 42.6 （C-8′）, 72.1 （C-9′）,101.2 （C-10′, -OCH2O-）, 103.7 （glc-C-1″）, 74.0（C-2″）, 77.2 （C-3″）, 70.5 （C-4″）, 77.5 （C-5″）,61.5 （C-6″）。 以上数据与文献[15] 一致, 故鉴定为二氢芝麻素-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物14： 无色针晶（甲醇）； ESI-MS m/z：349 [M + Na]+。1H-NMR （CD3OD, 400 MHz） δ：7.09 （1H, d, J=8.2 Hz, H-6）, 6.82 （1H, d, J=1.8 Hz, H-3）, 6.73 （1H, dd, J=8.2, 1.9 Hz, H-5）, 5.95 （1H, m, H-8）, 5.07 （2H, m, H-9）,4.85 （1H, d, J=7.3 Hz, glc-H-1′）, 3.87 （1H, d,J=12.5 Hz, glc-H-6′a）, 3.83 （3H, s, -OCH3）,3.70 （1H, m, glc-H-6′b）,3.49-3.31 （6H, m, glc-H-2′～5′, H-7）；13C-NMR （CD3OD, 100 MHz） δ：145.0 （C-1）, 149.5 （C-2）, 112.8 （C-3）, 135.1（C-4）, 120.8 （C-5）, 116.9 （C-6）, 39.4 （C-7）,137.7 （C-8）, 114.5 （C-9）, 55.4 （2-OCH3）,101.8 （glc-C-1′）,73.6 （C-2′）,76.9 （C-3′）,70.0（C-4′）,76.5 （C-5′）,61.2 （C-6′）。 以上数据与文献[16] 一致, 故鉴定为丁香酚苷。

化合物15： 白色粉末（甲醇）； ESI-MS m/z：553 [M + Na]+。1H-NMR （CD3OD, 400 MHz） δ：7.63 （1H, d, J=15.9 Hz, H-7″）, 7.56 （1H, d,J=15.9 Hz, H-7′）, 7.06 （2H, brs, H-2′, 2″）,6.97 （2H, d, J=8.1 Hz, H-5′, 5″）, 6.79 （2H,dd, J=8.1, 1.6 Hz, H-6′, 6″）, 6.36 （1H, d, J=15.9 Hz,H-8″）,6.23 （1H,d,J=15.9 Hz,H-8′）,5.40 （1H, m, H-5）, 5.31 （1H, m, H-3）, 3.98（1H, m, H-4）, 3.68 （3H, s, -OCH3）, 2.34-2.27（2H, m, H-6）； 2.20-2.11 （2H, m, H-2）；13CNMR （CD3OD, 100 MHz） δ： 73.3 （C-1）, 34.3（C-2）, 70.6 （C-3）, 68.3 （C-4）, 70.9 （C-5）,35.4 （C-6）, 174.3 （C-7, -C=O）, 126.3 （C-1′）,113.8 （C-2′）,145.5 （C-3′）,148.2 （C-4′）,115.2（C-5′）, 121.7 （C-6′）, 145.8 （C-7′）, 113.5 （C-8′）, 166.6 （C-9′）, 126.6 （C-1″）, 113.8 （C-2″）,145.6 （C-3″）,148.4 （C-4″）,115.2 （C-5″）,121.8（C-6″）, 146.1 （C-7″）, 114.1 （C-8″）, 167.4 （C-9″）, 51.7 （7-OCH3）。 以上数据与文献[16] 一致, 故鉴定为3, 5-双咖啡酰奎宁酸甲酯。

化合物16： 白色粉末（甲醇）； ESI-MS m/z：553 [M + Na]+。1H-NMR （CD3OD, 400 MHz） δ：7.62 （1H, d, J=16.0 Hz, H-7″）, 7.52 （1H, d,J=16.0 Hz, H-7′）, 7.02 （1H, d, J=1.6 Hz, H-2′）, 7.00 （1H, d, J=1.6 Hz, H-2″）, 6.92 （2H,dd, J=8.0, 1.6 Hz, H-6′, 6″）, 6.76 （2H, d, J=8.0 Hz, H-5′, 5″）, 6.31 （1H, d, J=16.0 Hz, H-8″）, 6.19 （1H, d, J=16.0 Hz, H-8′）, 5.53 （1H,m, H-3）, 5.12 （1H, m, H-4）, 4.35 （1H, m, H-5）, 3.71 （3H, s, -OCH3）, 2.35 ～2.27 （2H, m,H2-6）； 2.23 ～2.05 （2H, m, H-2）；13C-NMR（CD3OD, 100 MHz） δ： 74.4 （C-1）, 37.0 （C-2）,67.2 （C-3）, 73.4 （C-4）, 67.7 （C-5）, 37.0 （C-6）,173.8 （C-7,-C=O）,126.3 （C-1′）,113.3 （C-2′）, 145.5 （C-3′）, 148.4 （C-4′）, 115.2 （C-5′）,121.8 （C-6′）,146.4 （C-7′）,113.8 （C-8′）,167.1（C-9′）, 126.2 （C-1″）, 113.2 （C-2″）, 145.5 （C-3″）, 148.4 （C-4″）, 115.2 （C-5″）, 121.8 （C-6″）,146.4 （C-7″）, 113.8 （C-8″）, 166.5 （C-9″）, 51.7（7-OCH3）。 以上数据与文献[16] 一致, 故鉴定为3, 4-双咖啡酰奎宁酸甲酯。

化合物17： 白色粉末（甲醇）； ESI-MS m/z：553 [M + Na]+。1H-NMR （CD3OD, 400 MHz） δ：7.63 （1H, d, J=16.0 Hz, H-7″）, 7.56 （1H, d,J=15.9 Hz, H-7′）, 7.06 （2H, brs, H-2′, 2″）,6.97 （1H, dd, J=8.0, 1.6 Hz, H-6′, 6″）, 6.78（1H, d, J=8.0 Hz, H-5″）, 6.74 （1H, d, J=8.4 Hz, H-5′）,6.36 （1H, d, J=16.0 Hz, H-8″）,6.23（1H, d, J=16.0 Hz, H-8′）, 5.73 （1H, m, H-4）,5.69 （1H, m, H-5）, 5.40 （1H, m, H-3）, 3.69（3H, s, -OCH3）,2.35～2.10 （4H, m, H-2, H-6）；13C-NMR （CD3OD, 100 MHz） δ： 80.4 （C-1）, 37.6（C-2）, 68.6 （C-3）, 70.3 （C-4）, 71.3 （C-5）,37.4 （C-6）, 173.3 （C-7, -C=O）, 126.3 （C-1′）,113.8 （C-2′）,145.5 （C-3′）,148.3 （C-4′）,115.2（C-5′）, 121.7 （C-6′）, 145.8 （C-7′）, 113.5 （C-8′）, 166.6 （C-9′）, 126.5 （C-1″）, 113.8 （C-2″）,145.6 （C-3″）,148.4 （C-4″）,115.2 （C-5″）,121.8（C-6″）, 146.1 （C-7″）, 114.1 （C-8″）, 167.4 （C-9″）, 51.7 （7-OCH3）。 以上数据与文献[17] 一致, 故鉴定为1, 3-双咖啡酰奎宁酸甲酯。

4 抗炎活性

4.1 MTT 法细胞毒性试验 取对数生长期RAW264.7/BV2 细胞接种于96 孔板中（1×105个细胞/孔）, 37 ℃、 5%CO2条件下温孵培养12 h后, 给药组分别加入不同质量浓度的待测样品（最终质量浓度分别为50、 100、 200 μg/mL）, 同时每种药物均设加入或不加入LPS （1 μg/mL） 2组。 溶剂对照组均不加入受试药物及LPS, 但加入0.1% DMSO。 继续温孵培养12 h 后, 每孔取出100 μL 上清液, 加入100 mg/mL MTT 工作液孵育0.5 h。 形成的甲臜盐使用酸化异丙醇溶解, 在酶标仪540 nm 处测定各孔吸光度（A） 值, 以正常组细胞（未处理） 的A 值所对应的细胞存活率为100%, 计算细胞存活率。 每组重复3 次独立实验。结果见表1。

4.2 对NO 的抑制作用 采用Griess 法检测对LPS刺激下的RAW264.7/BV2 细胞分泌NO 的抑制作用。 取对数生长期RAW264.7/BV2 细胞接种于96孔板中（1×105个细胞/孔）, 37 ℃、 5% CO2条件下温孵培养12 h 后加入100 μL 不同质量浓度的待测样品（最终质量浓度分别为50、 100、 200 μg/mL）,温孵培养1 h 后加入100 μL 1 μg/mL LPS, 同时设模型组（LPS+培养液）、 阳性对照组（紫铆因+LPS+培养液）、 空白对照组（培养液）, 继续温孵培养12 h。 每组重复3 次独立实验。 将上清液（100 mL） 与等体积格氏试剂混合, 用酶联免疫检测仪测定混合物在540 nm 处的A 值, 计算NO 抑制率, 结果见表2。

表1 各粗提物对LPS 刺激的RAW264.7/BV2 细胞存活率的影响Tab.1 Effects of cell viability of different extracts on LPSstimulated RAW264.7/BV2 cells

表2 各粗提物对LPS 刺激的RAW264.7/BV2 细胞NO 抑制作用Tab.2 Inhibitory effects of different extracts on LPS-stimulated NO production in RAW264.7/BV2 cells

5 讨论

本研究首次对糙叶五加花进行了抗炎活性导向下的化学成分研究, 且从抗炎活性较好的乙酸乙酯萃取部位中分离鉴定出17 个化合物, 包括6 个黄酮及其苷类、 9 个咖啡酰基奎宁酸类、 1 个木脂素苷类、 1 个苯丙素苷类。 其主要成分为带有槲皮素或山柰酚母核的黄酮类及二取代的咖啡酰基奎宁酸类, 进一步丰富了五加科五加属植物的研究内容,同时为中国特产植物糙叶五加的研究提供参考。 由于近年来许多研究者对于咖啡酰基奎宁酸类化合物的取代基编号命名各不相同, Clifford[18]把绿原酸、 隐绿原酸、 新绿原酸分别命名为5-O-咖啡酰基奎宁酸、 4-O-咖啡酰基奎宁酸、 3-O-咖啡酰基奎宁酸。 后来的大多数研究者均采用此法命名。 然而, 根据国际纯粹与应用化学联合会 （IUPAC）命名规则, 绿原酸、 隐绿原酸、 新绿原酸应分别命名为3-O-咖啡酰基奎宁酸、 4-O-咖啡酰基奎宁酸、5-O-咖啡酰基奎宁酸。 本研究按照IUPAC 命名法对二取代的咖啡酰基奎宁酸类化合物进行取代基编号及命名, 以期对以后该类化合物的结构解析和命名提供参考。 对于这些单体化合物的潜在抗炎活性有待进一步研究。