基于代谢组学的多西他赛调控肺癌细胞代谢重编程研究

孙海超 朴海龙 齐欢 颜敏 刘宏旭

肺癌不仅是中国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，也是全世界范围内病死率最高的恶性肿瘤[1]，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者约占肺癌患者总数的80%[2]。40%-50%的NSCLC患者在确诊时已经处于局部晚期或发生转移，5年生存率仅为5%。多西他赛（Docetaxel，多西紫杉醇）属于紫杉醇类，是一种微管稳定剂[3]，通过稳定微管蛋白质，抑制微管解聚和肿瘤细胞有丝分裂，发挥其抗肿瘤作用，临床上主要用于治疗NSCLC、乳腺癌、前列腺癌和宫颈癌等[4]。目前，多西他赛是治疗局部晚期或发生转移的NSCLC患者的一线用药[5]，其对顺铂治疗产生耐药性的患者也有效[6]。但是，多西他赛治疗NSCLC的分子机制尚未完全阐明。

代谢物变化是对细胞所进行生理活动的最直观反应，代谢物对研究细胞生理和病理机制具有重要意义，目前已鉴定出的生物体内代谢物大于4万个[7]。代谢组学是一种新兴的研究方法，是对整个生物体系总的代谢物所进行的全面定性定量研究[8]。其和基因组学、转录组学、蛋白质组学一起，成为系统生物学的重要研究方法。色谱-质谱联用以其高分辨力、高通量和高灵敏度的优势，已成为代谢组学的主流研究技术之一。基于气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS）技术的代谢组学方法在检测糖酵解、三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环、氨基酸和有机酸等代谢物中具有优势。并且，相对于其他代谢组学技术，GCMS技术较成熟、仪器更加稳定、价格便宜[9]。

1922年瓦博格首次发现，肿瘤的发生发展与糖酵解代谢异常密切相关。在氧气充足的条件下，细胞大量摄取葡萄糖生成乳酸，激活相关信号通路和改变肿瘤微环境。相关研究表明，许多调控代谢的相关蛋白质可以调控细胞凋亡的发生，同时某些调控细胞凋亡的蛋白质也在代谢通路中发挥信使作用。靶向肿瘤代谢治疗的研究是基于代谢组学的方法，通过分析肿瘤异常代谢物和代谢通路，使用现有的生物化学技术合成新的靶向代谢的药物，为治疗肿瘤寻找新的突破点，为预防肿瘤寻找新的策略[10]。靶向肿瘤代谢的基本研究方法包括：①靶向代谢突变基因和激活的代谢基因；②回补肿瘤内缺失的代谢基因；③靶向代谢通路重编程等。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 使用GCMS-QP 2010Plus系统进行GC-MS代谢组学分析（日本岛津公司）。自动进样器：AOC-20i autosampler（日本岛津公司）。观察细胞使用倒置显微镜（德国Leica公司）。Western blot分析使用Fusion Fx化学发光仪（法国VILBER公司）。CO2培养箱、96孔板、细胞培养皿等均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

超纯水来自于Milli-Q水纯化系统（美国Millipore公司）。40 mg/mL多西他赛（溶于吐温80溶剂）购于齐鲁制药有限公司。甲氧胺盐酸盐、吡啶、二氯甲烷及N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（MSTFA）和十三酸均购自美国Sigma-Aldrich公司。色谱纯甲醇购自德国Merck公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、青霉素链霉素液（penicillin-streptomycin, PS）、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline, PBS）、通用细胞冻存液和0.25%EDTA胰蛋白酶均购自美国Gibco公司。

人源NSCLC细胞A549和H1299购自中国科学院上海细胞库，并使用含10%FBS及1%PS的RPMI-1640培养基进行培养。细胞培养在5%CO2、37 ℃恒温孵箱中。细胞培养至密度为80%-90%时进行传代。

1.2 CCK-8测定细胞活力 活细胞内线粒体脱氢酶可与细胞增殖及毒性检测试剂（cell counting kit-8, CCK-8）反应变橙色。使用96孔板培养细胞，消化处于对数生长期的细胞，96孔板每孔接种3,000-5,000个细胞，24 h后A549和H1299细胞按照梯度0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM处理多西他赛，平行设置三个对照组。继续培养24 h、48 h、72 h后，吸取上清后每孔按照1:9（CCK-8:培养基）加入CCK-8试剂100 μL，培养2 h后使用酶标仪（450 nm波长）测取并计算平均吸光度值A，细胞活力（%）=（A处理组-A空白组）/（A对照组-A空白组）。

1.3 蛋白质免疫印迹分析 分别取对数生长期的A549和H1299细胞2×106个接种于4个10 cm2细胞培养皿。24 h后分别在培养基中加入30 nM和100 nM的多西他赛，处理0 h、6 h、12 h和24 h。弃去培养基，PBS清洗3次后。加入RIPA裂解液，刮下细胞，并将含细胞碎片的裂解液移至新离心管中。冰上裂解细胞1 h，每10 min涡旋一次。4 ℃，13,000g离心15 min，取上清。通过BCA法测定蛋白质浓度，等量蛋白质加入蛋白质上样缓冲液后，97 ℃变性10 min。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同分子量大小的蛋白质，再将蛋白质转移至PVDF膜上。室温封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜。室温孵育二抗1 h，加入显影剂，化学发光成像仪检测蛋白质条带。本研究所用一抗：Vinculin，购自美国Sigma-Aldrich公司，1:1,000稀释使用；PARP、IDH1和IDH2均购自美国Proteintech公司，1:1000稀释使用。

1.4 样品提取及衍生 分别取对数生长期的A549和H1299细胞2×106个接种于10个10 cm2细胞培养皿。24 h后，5组作为处理组分别加入药物多西他赛30 nM（A549）或100 nM（H1299），5组作为对照组仅换液。药物处理24 h后，弃去培养基，使用5 mL冷PBS缓冲液轻柔冲洗细胞两次，立即液氮淬灭。加入含10 μg/mL十三酸的甲醇：水（4:1）1 mL，刮下细胞至（Eppendorf, EP）管中。涡旋两次，每次1 min。4 ℃，13,000g离心15 min，取上清，真空干燥冻干机（美国Labconco公司）中冻干[11]。

取出冻干样品，每个样品加50 μL甲氧吡啶（20 mg/mL），涡旋60 s，37 ℃水浴肟化1.5 h。再加入40 μL MSTFA，涡旋30 s，37 ℃水浴，硅烷化1 h。4 ℃，13,000g离心15 min。弃去不溶颗粒沉淀，取上清行GC-MS分析[12]。

1.5 GC-MS条件 色谱条件：使用DB-5 MS（30 μm×250 μm×0.25 μm；美国J&W Scientific公司）毛细管柱；使用程序性升温进行分析，起始温度为70 ℃，保持3 min后，以5 ℃/min速率升高温度至300 ℃，保持10 min；接口温度230 ℃；电离模式70 eV；进样量1 μL；载气线性速度40.0 cm/s，恒流模式流速1.19 mL/min；采用全扫描模式；扫描范围33 m/z-600 m/z。

针对当前农村小学生口语交际信心不足的现状，教师应当在日常的教学活动中，加强和学生之间的沟通交流，树立学生口语交际的自信心。首先，构建和谐互动的课堂教学氛围，在潜移默化中培养学生善于交际的能力。农村小学语文教师要改变过去“一言堂”的教育模式，在课堂教学中积极和学生之间交流互动，形成融洽的交际氛围，消除学生的心理障碍和畏难情绪；其次，针对个别自信心尤其不足的孩子，农村小学语文教师要积极沟通，了解原因，积极鼓励，帮助学生树立信心，为培养学生的口语交际和表达能力奠定基础。

1.6 数据处理与统计分析方法 GC-MS所获取的原始质谱数据（CDF格式）通过ChromaTOF 4.43软件（美国LECO公司）进行处理，结合数据库及组内标样，进行代谢物定性。通过GC-MS solution软件进行代谢物积分定量。得到代谢物峰表后，使用SIMCA-P 11.0软件（瑞典Umetrics公司）进行偏最小二乘法判别分析，绘制PLS-DA得分图，可视化组间聚集及离散程度。运用统计学t检验方法（P＜0.05），得到对照组和多西他赛处理组的A549和H1299细胞差异代谢物。使用MeV热图软件绘制差异代谢物热图，使用MetaboAnalyst 3.0在线软件进行通路富集分析，使用GraphPad Prism 5绘图软件制作柱状图。

2 结果

2.1 多西他赛对NSCLC细胞A549和H1299的抑制作用 为探讨多西他赛对NSCLC增殖的影响，本实验采用CCK-8试剂盒测定了多西他赛对A549和H1299细胞活力的作用。图1A-图1B为多西他赛8个浓度梯度和3个作用时间对A549和H1299细胞活力的影响。随着多西他赛药物浓度升高和作用时间延长，A549和H1299细胞活力下降，多西他赛对NSCLC的增殖抑制作用具有明显的浓度和时间依赖性。

为探讨多西他赛对NSCLC凋亡的作用。通过Western blot实验，测定多西他赛作用A549和H1299细胞0 h、6 h、12 h和24 h时，凋亡敏感指标PARP蛋白质表达。结果表明，随着多西他赛处理时间延长，A549和H1299细胞中的PARP蛋白质均逐渐被激活裂解形成P89片段（图1C），细胞发生凋亡。上述结果提示多西他赛能诱导NSCLC发生凋亡。

2.2 GC-MS代谢组学技术分析多西他赛处理前后的A549和H1299细胞差异代谢物 基于代谢组学中需要活细胞提取代谢物进行分析的基础上，综合考虑多西他赛对NSCLC增殖和凋亡的影响，保证多西他赛的药理作用，同时保持相当程度的细胞活力。根据CCK-8实验结果，选择作用A549细胞的药物浓度为30 nM，作用H1299细胞的药物浓度为100 nM，作用时间为24 h，A549和H1299细胞活力均在70%-80%之间，实验具有可行性。

提取代谢物前使用液氮淬灭细胞，去除微环境变化对细胞代谢状态的影响[14]。依前述方法样品经提取硅烷化衍生，利用GC-MS技术分析细胞代谢物。得到对照组和多西他赛处理组A549和H1299细胞代谢物的GC-MS总离子流图。

考虑到非药物因素的影响，排除复杂的环境条件干扰，最大化组间分离，并寻找各组间的差异代谢物。进一步通过偏最小二乘法判别分析（partial least square discriminant analysis, PLS-DA）经行多元数据处理。图2是对照组和处理组A549和H1299细胞代谢物全谱数据的PLS-DA得分图，该模型包含两个主成分[14]，其中R2X=0.831、R2Y=0.983和Q2=0.878，提示该模型具有较高的稳定性和较好的预测率。在PLS-DA得分图上，对照组和处理组A549和H1299细胞代谢物可以明显的区分开。

图2 对照组和多西他赛处理24 h的A549和H1299细胞代谢物的PLS-DA得分图（n=5）Fig 2 PLS-DA score plot of control and docetaxel treated A549 and H1299 cells for 24 h (n=5)

图3 多西他赛对A549和H1299细胞中代谢物和代谢通路的影响（n=5）。A-B：对照组和多西他赛处理24 h组的A549细胞（A）和H1299细胞（B）差异代谢物的热图；C：韦恩图统计A549和H1299细胞中共同的差异代谢物，并对8种差异代谢物进行通路富集分析。Fig 3 Effects of docetaxel on metabolites and metabolic pathways in A549 and H1299 cells (n=5).A-B: Heatmap of metabolites in A549 cells (A)and H1299 cells (B) following docetaxel treatment for 24 h; C: Venn diagram of commonly differential metabolites in both A549 and H1299 cells.Pathway Impact analysis results by 8 differential metabolites.

图4 多西他赛对A549和H1299细胞的TCA循环的影响。A-E：对照组和多西他赛处理24 h的A549和H1299细胞中TCA循环中间产物：苹果酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸、α-酮戊二酸变化情况；F：对照组和多西他赛处理6 h的A549和H1299细胞的TCA循环关键酶IDH1和IDH2蛋白质的表达。n=5，*P＜0.05，**P＜0.01及*** P＜0.001。Vinculin作为内参蛋白质。Fig 4 Effects of docetaxel on TCA cycle in A549 and H1299 cells.A-E: Alterations of intermediate metabolites of TCA cycle, included malic acid,fumaric acid, succinic acid, citric acid, α-ketoglutaric acid, in control and docetaxel treatment group in A549 and H1299 cells for 24 h; F: The expression of the key enzymes protein of TCA cycle, included isocitrate dehydrogenase 1 and isocitrate dehydrogenase 2, in control and docetaxel treatment group in A549 and H1299 cells for 6 h.n=5, *P＜0.05, ** P＜0.01, *** P＜0.001 vs the control group.Vinculin was used as a loading control.

结合t检验的统计方法，得到多西他赛处理前后的A549差异代谢物31种和H1299细胞差异代谢物19种，MeV热图分析提示处理组的大部分代谢物含量下降 (图3A-图3B）。处理组A549细胞的丙酮酸、丙酸、甘氨酸等25种代谢物含量下降，丝氨酸、磷酸、腺嘌呤等6种代谢物含量上升。处理组H1299细胞的乳酸、琥珀酸、胆固醇等11种代谢物含量下降，乳糖、木糖醇、葡萄糖等8种代谢物含量上升。

2.3 多西他赛可下调NSCLC的TCA循环代谢途径 多西他赛处理组A549和H1299的共同差异代谢物包括：苹果酸（malic acid）、富马酸（fumaric acid）、琥珀酸（succinic acid）、柠檬酸（citric acid）、亚牛磺酸（hypotaurine）、核糖酸（ribonic acid）、棕榈酸（palmitic acid）和谷胱甘肽（glutathione），在药物处理后含量下降。通过使用在线工具MetaboAnalyst 3.0软件，进行8种共同差异代谢物的通路富集分析（图3C），结果显示主要影响TCA循环代谢途径（P=0.002,14）。

图4A-图4E所示为多西他赛处理后含量下降的TCA循环中间产物。苹果酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸在处理组的A549细胞中含量下降。苹果酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸、α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid）在处理组的H1299细胞中含量下降。

异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）是TCA循环过程中的关键酶，可催化异柠檬酸转化为α-酮戊二酸。对对照组和多西他赛处理6 h后的A549和H1299细胞进行Western blot分析，药物处理6 h后IDH1和IDH2蛋白质的表达量下降（图4F）。推测多西他赛通过抑制TCA循环关键酶，下调NSCLC细胞的TCA循环。

3 讨论

本研究通过CCK-8实验、Western blot分析，使用基于GC-MS技术的代谢组学方法，结合多种统计软件，探索多西他赛对A549和H1299细胞代谢的影响。结果表明，多西他赛对NSCLC的主要作用有：①可浓度和时间依赖地抑制细胞活力和诱导细胞凋亡；②下调TCA循环的中间代谢物：苹果酸、富马酸、琥珀酸和柠檬酸含量，同时也下调亚牛磺酸、核糖酸、棕榈酸、谷胱甘肽的含量；③下调TCA循环的关键酶异柠檬酸脱氢酶蛋白质水平。

TCA循环是产生ATP的一条重要电子传递链，主要在生物体细胞的线粒体内进行[15]，是生物能量的重要来源，同时也为肿瘤细胞增殖提供了必要条件。TCA循环与NSCLC的发生发展密切相关[16]。TCA循环中的关键酶：琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase）、异柠檬酸脱氢酶和延胡索酸水合酶（fumarate hydratase）突变表达的非小细胞肺癌患者有着更高的复发率和死亡率[17]。研究[18]表明，通过分析注射同位素13C标记葡萄糖肺癌患者的肺组织，相比正常肺组织，肺癌组织内大量的13C富集在琥珀酸和柠檬酸中。大量葡萄糖经过TCA循环转化为脂质、蛋白质和核酸以满足肺癌组织生长的高合成代谢需求。

靶向代谢重编程药物的研究，主要是针对肿瘤细胞内存在的异常代谢。瓦博格提出，在氧气绝对充足的条件下，相比于正常组织，肿瘤组织的细胞内氧化磷酸化被抑制[19]，糖酵解水平升高200倍以上（瓦博格效应）。糖酵解通过转化为谷氨酰胺合成α-酮戊二酸，参与TCA循环，促进肿瘤的进一步发展[20]。添加外源柠檬酸，负反馈调节抑制肿瘤细胞的TCA循环可抑制A549细胞的增殖和裸鼠异体移植瘤的生长[21]，研究结果表明对代谢重编程的调控可以治疗NSCLC。

代谢组学是研究生物体系内各种生理活动调节后最终状态的学科，为本研究提供了重要的理论基础。GCMS气相色谱质谱联用技术，为本研究提供了技术上的可行性。通过对差异代谢物的代谢组学分析，发现多西他赛作用于NSCLC细胞后TCA循环等代谢通路的改变，证明了多西他赛对代谢通路调控作用。后续实验需进一步验证多西他赛作用于TCA循环的机制，三羧酸循环影响NSCLC的机制和多西他赛对代谢调控作用的动物实验。希望可通过本研究，为靶向代谢重编程药物的开发和药理学研究提供一种新的策略。