四神丸对慢性复发型结肠炎大鼠结肠组织LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力的影响❋

王海燕，刘 億，葛 巍，鹿秀云，李燕珍，刘端勇Δ，赵海梅Δ

(1. 江西中医药大学,南昌 330004； 2. 江西中医药大学附属医院,南昌 330006)

四神丸出自南宋·许叔微所撰写的《普济本事方》，由二神丸与五味子散组合而成，主治脾肾阳虚之肾泄[1]。现代研究表明，能量代谢状态紊乱是包括UC在内的炎症性肠病发病的重要特征之一[2]，而四神丸具有温补脾肾之阳的功效，然其能否调控能量代谢水平达到治疗UC的目的鲜见报道。本研究将通过测定大鼠结肠组织LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和 Ca2+-Mg2+-ATPase活力变化，以阐述四神丸治疗实验性大鼠UC的可能机制。

1 实验材料

1.1 动物及分组

健康SD雄性大鼠60只，体质量180～200 g，由湖南斯莱克景达实验动物公司提供(合格证号SCXK(湘)2013-0004)。将大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、四神丸高、中、低剂量组和美沙拉嗪对照组各10只，适应性喂养1周后用于实验。

1.2 主要药物和试剂

四神丸(SSP)购于北京同仁堂天然药物(唐山)有限公司(生产批号16080053)；美沙拉嗪肠溶片购于葵花药业集团佳木斯鹿灵制制药有限公司(生产批号170438)；三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS)分子量为293.17，购于SIGMA公司(生产批号SLBP0899V)。

1.3 主要仪器与试剂

低温高速离心机(德国Eppendorf)、722型分光光度计(上海仪电)；LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 模型复制

参照文献[3]和结合前期研究复制慢性复发性UC大鼠模型。第1天，动物麻醉(3%戊巴比妥0.14 ml/kg)，用0.29 mm直径塑料软管从肛门将0.8 ml 5%TNBS/ 50%乙醇混合溶液(3 mg/kg TNBS)注入结肠8 cm处，倒置待动物自然苏醒。第14、28天重复上述操作，正常组注入等量生理盐水。

2.2 给药方法

第29天，四神丸低、中、高剂量组分别给予1.25、2.5、5 g/kg四神丸灌胃1周，美沙拉嗪对照组给予150 mg/kg美沙拉嗪灌胃1周。

2.3 标本采集及处理

第36天，动物麻醉处死，截取结肠PBS洗净污秽物。留取部分结肠组织4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，观察结肠病理改变；剩余组织置于-80 ℃冰箱保存，用于检测LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase的活力值。

2.4 一般状态评价

观察动物毛发、进食、大便性状及活动状态。

2.5 结肠黏膜肉眼损伤评分及镜下病理评分

观察结肠黏膜充血、水肿、溃疡及淋巴结等情况，测定结肠质量和长度。参照文献[4-5]进行结肠黏膜肉眼及镜下结肠组织病理损伤形态学评分。

2.6 结肠组织LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力值检测

大鼠麻醉后快速脱椎处死，分离结肠组织，冰PBS溶液冲洗，制备生理盐水组织匀浆，3500 r/min离心15 min分离上清液，并采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活力值检测按照试剂盒说明书，采取诱导促酶反应和定磷法测定其ATP酶活性，LDH、SDH活力值检测按照试剂盒说明书规范操作，采用分光光度计法测定其活性，由南京建成生物科技有限公司完成。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 一般状况变化

与正常组比较，模型组大鼠毛发暗淡不光泽、参差不齐，大便溏稀潜血、肛周污秽、少食少动、嗜睡怕冷、精神极度萎靡；各治疗组与模型组比较，食量增加、活跃多动、大便成型，状态好转。

3.2 结肠黏膜肉眼损伤评分及镜下病理评分结果

图1表1显示，肉眼观察发现，TNBS诱导后大鼠结肠黏膜充血、水肿，溃疡面形成，结肠皱襞纹理粗细杂乱；各治疗组结肠黏膜充血、水肿减轻，溃疡甚小。显微镜观察发现，模型组黏膜病灶可见上皮组织缺失、水肿、充血，大量炎细胞浸润，伴见溃疡形成；各治疗组大鼠结肠基本恢复正常，伴有少量炎性细胞浸润。与正常组比较，模型组结肠质量、结肠肉眼下及镜下损伤评分均明显升高(P<0.01)，结肠长度则明显缩短(P<0.01)；而经四神丸给药治疗后，与模型组比较，各给药组结肠质量、结肠肉眼下及镜下损伤评分均明显下降(P<0.01)，结肠长度则明显恢复(P<0.01)。上述结果表明，四神丸可有效治疗慢性复发型结肠炎。

注：A.正常组；B.模型组；C.四神丸高剂量组；D. 四神丸中剂量组；E. 四神丸低剂量组；F.美沙拉嗪组图1 各组大鼠结肠黏膜病理损伤HE染色比较 (×100)

3.3 结肠组织LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力变化

表2显示，与正常组比较，模型组结肠黏膜组织中SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力均显著下降 (P<0.05或0.01)，LDH活力明显提升(P<0.05)；而各治疗组均能降低LDH活力，同时显著提升SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活力(P<0.05)。上述结果表明，四神丸可有效调控慢性复发型结肠炎大鼠能量代谢状态和水平。

4 讨论

本实验观察到，大鼠经TNBS灌肠造模后，大鼠结肠黏膜损伤、炎症细胞浸润、溃疡形成，肉眼及镜下损伤评分明显升高，与以往UC动物模型相似[6]。同时伴见Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力显著下降，提示TNBS诱导的结肠炎大鼠结肠黏膜能量代谢状态紊乱。

表1 四神丸治疗慢性复发型结肠炎大鼠的疗效评价(分，

注：与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

表2 四神丸对慢性复发型结肠炎大鼠能量代谢相关指标影响比较

注：与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

结肠上皮组织的破坏损伤是溃疡性结肠炎的重要病理特征，而能量代谢紊乱是导致结肠黏膜上皮细胞通透性增加的重要原因之一[2]。ATP的耗竭可引起上皮细胞间连接骨架的萎缩、断裂、减少，进而导致肠上皮细胞间隙增宽，结肠黏膜上皮间通透性增加，肠黏膜屏障破坏，致使细菌、抗原等致炎物质穿过肠黏膜屏障，进入固有层激活炎症反应，最终诱导炎症损伤[7]。然而能量代谢相关酶活性改变对肠上皮细胞屏障功能和能量代谢同样具有重要意义。ATP酶(ATPase)是一种广泛存在于哺乳动物组织细胞膜上的载体蛋白，参与细胞的物质代谢和能量转换过程。其中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase可利用离子梯度差通过与各离子亲和力的改变，将细胞内外的电离子、营养物和代谢物等逆电化学梯度从低浓度侧向高浓度侧跨膜转运，这种耗能的主动运输方式对细胞渗透压的平衡和细胞体积的恒定有重要意义，也为细胞生长发育提供了能量及物质基础[8]。有研究发现，慢性肠炎动物模型的肠绒毛细胞存在Na+-K+-ATPase活性下降，究其原因与细胞连接骨架锚定蛋白的表达能力退化有关[9]。进一步提示，能量的缺乏是钠钾泵和钙镁泵功能异常的重要原因之一。LDH是葡萄糖无氧酵解的关键酶，当结肠组织受到损害时，可导致局部组织缺氧，代谢物大量堆积，自由基增多，进而引起细胞膜破损。而细胞可通过启动保护性代偿机制，增加LDH的分泌，催化乳酸氧化，故LDH可作为肠上皮细胞的损伤监测指标[10]。SDH为有氧代谢(三羧酸循环)的限速酶和线粒体的标志酶，通过其活性的改变可直接反映有氧反应的强弱和间接反映线粒体功能的好坏，可作为肠上皮细胞能量供给的参考[11]。在本实验中，TNBS诱导结肠黏膜时，使局部组织缺氧，能量代谢紊乱，骨架蛋白支撑乏力，ATP酶活力下降，正常电解质转运破坏，细胞受损，肠黏膜屏障功能受损，进而导致致病因素入侵，炎性损伤产生，溃疡形成，提示能量代谢状态紊乱是结肠炎的重要特征之一。经四神丸治疗后，结肠炎大鼠结肠质量、长度和病理损伤评分得到改善的同时，结肠组织LDH活力随之降低，SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力则相应提升。这与之前发现补骨脂连用肉豆蔻可改善大鼠肝组织能量代谢的结果相符[12]。进一步揭示了四神丸有效治疗慢性复发性UC的机制可能是通过干预肠上皮细胞的能量代谢，增加其能量供给，保证钠钾泵和钙镁泵的正常运行，以平衡细胞的渗透压，恒定细胞体积，保持肠上皮细胞屏障的完整性，进而减少致炎物质的侵入，缓解肠道炎症。但四神丸如何产生能量，与哪些基因或信号有关，是否存在免疫细胞活化都有待于进一步的深入研究。