粗叶泥炭藓原丝体增殖条件筛选研究

尹丽娟 （上海市园林科学规划研究院，上海市徐汇区 200232；上海城市困难立地绿化工程技术研究中心，上海市徐汇区 200232）

由于泥炭富含有机质和腐殖酸，既可直接作为栽培介质[1]，也可用作改良土壤的肥料[2]，故园艺产业的高速发展也成就了泥炭产业。但随着泥炭产业的发展，泥炭地被过度开采，这不仅对植被分布、生态多样性、自然碳汇功能造成严重破坏[3]，还导致我国由泥炭出口国逐渐成为进口国[4]。因此，亟需找到泥炭的替代品，以实现对泥炭资源的可持续利用，也可确保农业和园艺产业的高速发展。泥炭藓（Sphagnumsp.）又称水苔，是泥炭藓属植物的统称。德国等园艺发达国家的研究表明，泥炭藓可替代泥炭作为生长基质[5]，并已成功应用于杜鹃、欧石楠等植物的栽培中；泥炭藓由于吸水性极强[6-8]，还可用于食品保鲜[9]、提高植物嫁接成活率[10]等方面。

苔藓植物繁殖可分为有性生殖和无性生殖；成熟泥炭藓孢蒴中的孢子数量为6万～8万[11]，在人工培养下其萌发率可达60%[12]，繁殖系数极高；但在自然条件下，由于泥炭藓雌雄异株和受精过程过分依赖水分的特性，导致其有性生殖“衰退”[13]。因此，人为提高孢子体的利用率是泥炭藓快速繁殖的有效途径。有研究表明，原丝体阶段是泥炭藓有性生殖的必经阶段，且原丝体可独立生活，在苔藓生活史中占有重要地位；关于泥炭藓原丝体的报道大多集中在原丝体形态结构学方面的研究[13-16]，在泥炭藓的组织培养方面，仅有研究报道了三种泥炭藓原丝体在不同氮磷浓度、温度、光照条件下的发育状况[17]，且没有进行生长量化方面的描述，无法得知泥炭藓原丝体最佳生长条件；李大华[18]和姜山[19]等人虽研究了培养基种类、糖类、酒石酸铵、微量元素对不同种类泥炭藓茎尖生长的影响，但对泥炭藓原丝体快速增殖的相关研究还未见报道。因此，本研究以粗叶泥炭藓（Sphagnum squarrosum）无菌原丝体为材料，对培养基、pH、碳源和生长调节剂种类及浓度对其生长量的影响进行研究，以期找出泥炭藓原丝体快速增殖的途径，从而提高泥炭藓的园艺产量，为泥炭藓在园艺产业中的应用奠定基础。现将相关试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

带有孢蒴的粗叶泥炭藓植株采集于新疆喀纳斯，选择饱满、带柄的成熟孢蒴，在自来水下冲洗4 h后，转移至超净工作台上，用75%酒精消毒30 s、无菌水清洗3 次，然后用0.5%次氯酸钠（NaClO）消毒1 min，再用无菌水清洗干净后，挤破孢蒴，接种在knop 液体培养基上培养10 d 待用。

1.2 试验设计

培养基筛选试验：设培养基分别为BCD、Beneck（简称BM）、Knop（简称KM）、MS、1/2MS、1/4MS，以清水为对照。

培养基pH筛选试验：以Beneck为基本培养基，培养基的pH 分别设置为4、5、6、7、8。

碳源筛选试验：以Beneck 为基本培养基，添加浓度分别为0、5、10、20、40 g/L 的葡萄糖或蔗糖，以不加糖为对照。

生长调节剂筛选试验：以Beneck为基本培养基，添浓度分别为 0.1、1、10 μmol/L 的 IBA 和 6-BA，以不添加任何生长调节剂为对照。

过滤无菌泥炭藓原丝体，并用无菌水反复冲洗后，在18 000 r/min 条件下打碎，制成均匀的悬浮液，加入到以上培养基中，培养分为液体悬浮培养和固体培养，培养条件均为温度25 ℃、光周期16 h/8 h。培养20 d 后，称量原丝体生长量，计算增殖倍数。

计算公式：增殖倍数=（处理原丝体干重-对照原丝体干重）/对照原丝体干重。

1.3 数据处理与分析

数据采用Origin 7.5 和DPS 数据处理系统14.1进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 培养基筛选

由图1可知，粗叶泥炭藓在两种培养方式下，各培养基的增殖倍数均有差异。其中，Beneck 培养基和Knop 培养基最有利于粗叶泥炭藓原丝体的增殖；不同浓度的MS培养基上粗叶泥炭藓原丝体增殖效果差异不显著，但浓度越高繁殖越慢。说明粗叶泥炭藓原丝体适合在配方简单、盐度较低的培养基中生长，故以下试验均以Beneck 培养基为基本培养基。

图1 不同培养基种类对粗叶泥炭藓原丝体增殖的影响

2.2 pH筛选

培养基的pH 决定了泥炭藓原丝体生长的酸碱环境。由图2可知，在两种培养方式下，均以培养基pH 为5～6时，粗叶泥炭藓原丝体的增殖效果较好；培养基pH 为4时，两种培养方式的粗叶泥炭藓原丝体的增殖效果有所差异，以采用液体悬浮培养的增殖效果较好，且采用固体培养的泥增藓原丝体的殖效果显著低于培养基pH为5～6时。以上结果表明，弱酸环境适宜泥炭藓原丝体的增殖，而中性至弱碱性环境不利于泥炭藓原丝体的增殖，且pH 越高，其长势越差。

图2 不同pH对粗叶泥炭藓原丝体增殖的影响

2.3 碳源筛选

由图3可知，粗叶泥炭藓在无碳源的培养基中可以生长，但加入碳源后，其生长势明显增强。在两种培养方式下，蔗糖对粗叶泥炭藓原丝体增殖的促进作用均非常明显，而葡萄糖对粗叶泥炭藓原丝体增殖的促进作用以采用固体培养为优；采用液体悬浮培养时，蔗糖和葡萄糖的最佳浓度为5～10 g/L，采用固体培养时，蔗糖和葡萄糖的最佳浓度为10～20 g/L，这说明采用液体悬浮培养粗叶泥炭藓原丝体对糖的敏感程度更高。以上结果表明，培养基中添加中低浓度碳源可促进泥炭藓原丝体的增殖，但随着碳源浓度的升高，对增殖的促进作用逐渐降低。

此外，试验中还发现，在不同碳源的固体培养基上，有少量泥炭藓配子体分化现象出现。

图3 碳源对粗叶泥炭藓原丝体增殖的影响

2.4 生长调节剂筛选

由图4可知，两种生长调节剂均对粗叶泥炭藓原丝体的增殖有一定影响，且以采用液体悬浮培养的增殖效果优于采用固体培养。采用液体悬浮培养时，添加IBA 对粗叶泥炭藓原丝体增殖的促进作用不明显，且高浓度的IBA 会抑制粗叶泥炭藓原丝体的增殖；采用固体培养时，以低浓度（0.1 μmol/L）的IBA 对粗叶泥炭藓原丝体增殖的促进作用较好。在两种培养方式下，添加6-BA均有利于促进粗叶泥炭藓原丝体的增殖，且以低浓度的促进作用更为明显。

图4 激素对粗叶泥炭藓原丝体增殖的影响

2.5 培养方式筛选

由以上结果可知，在两种培养方式的不同试验条件下，粗叶泥炭藓原丝体的增殖存在差异。经相关性分析，液体悬浮培养和固体培养的粗叶泥炭藓原丝体的增殖结果呈极显著相关，相关系数为0.771**（n=31，R=0.449），这说明培养方式对粗叶泥炭藓原丝体增殖的影响不大，培养方式并不是粗叶泥炭藓原丝体的增殖结果差异的主要来源，而培养基的种类、pH 及添加物才是结果差异的原因所在。

3 结论与讨论

试验结果表明，粗叶泥炭藓原丝体的增殖生长受多个因素的影响，在无碳源和无生长调节剂的培养基中，粗叶泥炭藓原丝体也可以生长，但增殖效果不佳，在实际生产中的应用意义不大；而在培养基中加入碳源和生长调节剂或改变pH后，粗叶泥炭藓原丝体的增殖效果有显著变化，这有助于提高泥炭藓的园艺产量。在本试验条件下，低盐度的Beneck 和Knop 培养基较为适宜粗叶泥炭藓原丝体的增殖，且培养基的最佳pH 为5～6；碳源是提高粗叶泥炭藓原丝体增殖效果的关键因子，其中，蔗糖较葡萄糖更有利于促进粗叶泥炭藓原丝体的增殖，且以低浓度蔗糖的促进作用更为显著；高浓度IBA和6-BA 均会抑制粗叶泥炭藓原丝体的增殖，低浓度的6-BA 则能促进粗叶泥炭藓原丝体的增殖。

在培养基筛选试验中发现，苔藓培养常用的BCD 培养基及不同浓度的MS 培养基均不适宜用于粗叶泥炭藓原丝体的增殖，这与前人的研究结果一致。例如，李大华[20]在多纹泥炭藓茎尖培养中发现，采用MS 培养基不利于其萌发，以采用Beneck 和Knop培养基的多纹泥炭藓萌发株数最多；付素静[21]和于传梅[22]等发现，尖叶匐灯藓和短月藓均以在Beneck 和Knop 两种培养基上的增殖系数最大，而在MS 培养基上则生长较差，甚至变黄。由此可知，多数苔藓植物在高盐度的培养基上缓慢甚至受到抑制，而在相对简单的培养基上生长良好。

在培养基pH筛选试验中发现，粗叶泥炭藓原丝体在pH 较低的培养基上增殖效果较好，以pH 5～6 较为适宜，随着培养基pH 的升高，粗叶泥炭藓原丝体的增殖逐渐减少，甚至停止，这与泥炭藓人工培养的试验结果一致。例如，泥炭藓配子体在pH为6.0时生长速度最快[23]，说明泥炭藓喜偏酸性环境，这也与泥炭藓自然生境为偏酸性土壤相吻合。

在碳源筛选试验中发现，添加碳源能极大地促进粗叶泥炭藓原丝体的增殖，采用固体培养的最佳碳源浓度为10～20 g/L，较采用液体悬浮培养高，推测是由于液体悬浮培养条件下的培养基与粗叶泥炭藓原丝体的接触更加紧密，从而对糖浓度更加敏感所致，这也与前人的研究结果相一致。例如，姜山[24]发现糖是泥炭藓生长最主要的因子，且以培养基中添加5 g/L 葡萄糖时其生长最佳；李大华[18]在三种泥炭藓配子体固体培养中发现，添加20～25 g/L 蔗糖是其生长的最佳条件。同时，本试验在加入碳源的固体培养基上发现了粗叶泥炭藓的配子体，经分析，根据泥炭藓原丝体的生长规律，第20天左右为叶状原丝体阶段[25]，接着会逐渐分生为芽体，即配子体的初始形态，这与梁书丰[26]的研究结果一致，他在真藓培养过程中也发现，固体培养更有利于真藓原丝体的分化。

生长素主要促进细胞伸长，而细胞分裂素主要促进细胞分裂和扩大[27]。在生长调节剂筛选试验中发现，细胞分裂素6-BA 对粗叶泥炭藓原丝体增殖的促进作用大于生长素IBA，由此可以判断，粗叶泥炭藓原丝体的增殖方式偏向于细胞横向分裂及分支，而不是纵向伸长。同时，在两种培养方式下，粗叶泥炭藓原丝体采用液体悬浮培养的激素响应浓度也低于采用固体培养，推测这也是由于液体悬浮培养条件下培养基与粗叶泥炭藓原丝体的接触面积较固体培养的大而引起。