薤白皂苷对冠心病寒痰阻滞证患者血小板聚集率的影响及机制研究❋

邓 可，封 慧，王志鹏，王长松

(1. 句容市中医院，江苏 镇江 212400； 2. 东南大学附属中大医院，南京 210009)

血小板在冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗塞等过程中充当着重要角色，在这些病理过程中，血小板的黏附、释放等功能发挥重要功能。血小板膜上有多种受体，作为传递外界信号进入血小板的主要工具，决定了血小板对于不同激动剂和黏附蛋白的反应性。表面受体和内部颗粒在很大程度上决定了血小板的细胞特性[1]：与其他有核细胞不同，血小板缺少细胞核，因此无法依靠基因调控和蛋白合成应对于外界环境的改变，尽管有部分证据显示从巨噬细胞携带残留的mRNA具有合成蛋白的能力，但是大量的研究表明血小板主要依赖与多种受体传导信号来应对不同的生理条件和病理改变[2]。薤白有行气导滞、通阳散瘀的功效，是治疗胸痹、真心痛的要药。《伤寒论》及2011年版《中药、天然药物治疗冠心病心绞痛临床研究指导原则》中相关方剂“栝楼薤白白酒汤”“栝楼薤白半夏汤”“枳实薤白桂枝汤”是临床常用治疗胸痹、真心痛的名方[3]。研究表明，薤白中皂苷类化合物通过抗血小板聚集、抗氧化、降血脂参与冠状动脉粥样硬化的整个过程[4]，但其微观机制并未被解释。薤白中皂苷类化合物通过何种信号通路影响血小板的黏附、释放等功能尚待研究。为此本课题组研究了薤白皂苷化合物离体环境下对血小板活化因子诱导的血小板聚集的干预及对表面糖蛋白水平的影响，现描述如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

筛选2016年4月至2017年7月我科门诊收集的冠心病痰阻心脉证或阴寒凝滞证的患者共8例，47～75岁，同时符合冠心病和胸痹心痛中医证型诊断标准，签署知情同意书。冠心病诊断标准：患者均经冠状动脉造影证实，主要冠状动脉(左前降支LAD、左回旋支LCX、右冠状动脉RCA)中至少有一支内径狭窄>50%。涉及证型诊断参照2011年版《中药、天然药物治疗冠心病心绞痛临床研究指导原则》[3]中的胸痹心痛辨证分型：寒痰阻滞证需满足痰阻心脉证或阴寒凝滞证任意一个或两者均满足，由两名中医主治医师盲法确诊，诊断一致者即纳入。研究对象均排除急性感染、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、严重肝肾功能不全、I型糖尿病、甲状腺疾病、精神疾病及使用肝素、氯吡格雷、华法令等抗血栓药物者(阿司匹林除外)。所有入选者均自愿签署知情同意书。

1.2 药物及制备

薤白皂苷：将新鲜薤白鳞茎(南京鹤龄药事服务有限公司特别提供，产地：河南省平顶山市)捣碎，先用乙醇从中提取出薤白总皂苷，然后运用多种色谱学方法分离出已知化学结构的6种薤白皂苷(saponins from allium macrostemon bunge bulbs，SAMBB)混合物[6-7]。替卡格雷(astraZeneca AB，批号J20130020)500 mg/片。

1.3 主要试剂与仪器

ADP和人凝血酶，Hoffmann-La Roche Ltd；二甲基亚砜(DMSO)、MRS2179、MRS2395、Sigma Chemical Co.；CD61FITC、CD62pPE、Goat anti-Human IgG，美国Santa公司。AA和PAF溶解于PBS，于100 mmol/L Na2CO3和Tris-NaCl缓冲液分别加入0.25%牛血清白蛋白。高速离心机(型号GL10MA)，湖南凯达科学仪器有限公司；微孔板振荡器(型号MPS40)，上海达姆实业有限公司；流式细胞仪，美国BD公司；生物发光凝集测定仪，ChronoLog Corp，Havertown。

1.4 血小板制备

取患者静脉血10 ml，置于3.8%枸橼酸钠的CTAD真空管(BD公司)中，分别于180×g和1000×g离心10 min得富血小板血浆(PRP)，PRP以1000×g离心10 min，然后将细胞重悬于PBS(含有1.0%牛血清白蛋白和1 mmol/L CaCl2)中洗涤，通过台盼蓝拒染实验检测细胞存活率高于95%，将细胞浓度调至108/mL。

1.5 血小板聚集

体外血小板聚集：PRP中血小板聚集率参照文献[4]Born法所述进行测量。用生物发光凝集测定仪监测最大聚集率(诱导血小板聚集浓度ADP：3 μmol/L；AA：0.35 mmol/L；PAF：7.2 nmol/L)。计算药物抑制血小板聚集率。血小板聚集率=(A-B)÷A×100%。公式中A是添加对照物(生理盐水)时浊度的最大变化，B是加入药物(薤白皂苷、替卡格雷)时浊度的最大变化。

1.6 流式细胞术

血样分为对照组(未活化)、ADP诱导血小板凝集组、薤白皂苷低浓度组(0.3 mg/ml)、薤白皂苷中浓度组(0.6 mg/ml)、薤白皂苷髙浓度组(1.2 mg/ml)6组。室温温育10 min后，除静息组外其余各组均分别加入25uM ADP刺激5 min。取上述各组样品各5 μl，加入5 μl CD41PE/CD62pPE、5 μl CD61FITC，静息组加入5 μl抗人IgG-PE作为阴性对照，室温避光解育30 min，加PBS至0.5 ml重悬，混匀后上机检测。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 血小板聚集率

表1 薤白皂苷对ADP诱导冠心病寒痰阻滞证血小板聚集率的影响

注：与SAMBB高浓度比圈外:aP<0.05；与SAMBB高浓度比较：bP<0.01

表1显示，本步骤观察薤白皂苷(SAMBB)离体环境给药对ADP诱导的冠心病寒痰阻滞证血小板聚集的抑制作用，冠心病寒痰阻滞组中，薤白皂苷中浓度、高浓度与生理盐水对照组比较，可显著抑制ADP诱导的血小板聚集，并呈浓度依赖性(t=16.02，P<0.01；t=40.99，P<0.01)；阳性药替卡格雷抑制ADP诱导的血小板聚集率显著高于薤白皂苷高浓度组(t=8.20，P=0.005)。

2.2 CD62p的表达

表2显示，本实验使用25 μMol ADP作为诱导剂诱导富血小板血浆使血小板活化，采用流式细胞术检测不同浓度薤白皂苷给药前后血小板后膜蛋白CD62p表达率的变化。ADP诱导活化后，血小板膜蛋白CD62p表达率显著升高，4 μmol/L的薤白皂苷显著降低CD62p的表达率(t=-1.64，P<0.01)，表明薤白皂苷浓度依赖性地抑制血小板的活化。

表2 薤白皂苷对ADP活化的血小板CD62p、GPIIb/IIIa表达及联合ADP括抗剂对血小板活化的影响

注：与SAMBB高浓度比较：aP<0.05；与SAMBB高浓度比较：bP<0.01

2.3 GPIIb/IIIa的表达

表2显示，本实验使用25 μMol ADP作为诱导剂诱导富血小板血浆使血小板活化，采用流式细胞术检测不同浓度薤白皂苷给药前后血小板后膜蛋白GPIIb/IIIa表达率的变化。ADP诱导活化后，血小板膜蛋白GPIIb/IIIa表达率显著升高，4 μmol/L的薤白皂苷下GPIIb/IIIa的表达率与0.16 μmol/L的薤白皂苷下、未活化及活化后血小板膜蛋白GPIIb/IIIa表达率比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 通过ADP受体对血小板活化的影响

血小板膜上有2种ADP受体，分别是P2Y1和P2Y12。为分别研究薤白皂苷对这2种受体的作用，本研究用到P2Y1受体括抗剂MRS2179和P2Y12受体括抗剂MRS2395。

研究薤白皂苷对P2Y1受体作用，需联合括抗剂MRS2395(20 uMol)阻断P2Y12受体，低、中、高浓度的薤白皂苷联合括抗剂MRS2395下ADP诱导的血小板聚集率均显著高于ADP诱导的血小板聚集率(t=28.27，P<0.01；t=40.97，P<0.01；t=50.70，P<0.01)，并呈浓度依赖性。

研究薤白皂苷对P2Y12受体作用，需联合括抗剂MRS2179(20 uMol)阻断P2Y1受体，低、中、高的薤白皂苷联合括抗剂MRS2179下ADP诱导的血小板聚集率显著高于ADP诱导的血小板聚集率(t=41.70，P<0.01；t=43.67，P<0.01；t=50.96，P<0.01)，并呈浓度依赖性。

3 讨论

《伤寒论》中记载的“栝楼薤白白酒汤”“栝楼薤白半夏汤”“枳实薤白桂枝汤”是临床常用的治疗胸痹、真心痛的名方。薤白是治疗冠心病的要药，研究发现薤白中皂苷类化合物通过抗血小板聚集、抗氧化、降血脂参与冠状动脉粥样硬化的整个过程。《中医内科学》七版及2011年国家颁布的《中药、天然药物治疗冠心病心绞痛临床研究指导原则》[3]均指出，冠心病痰阻心脉证或阴寒凝滞证的治疗中需要用到薤白，故认为痰阻心脉证或阴寒凝滞证患者接受薤白治疗时的敏感度更高，符合中医“有是证则用是药”的范畴。本研究中将痰阻心脉证和阴寒凝滞证合称为寒痰阻滞证，即包含痰阻心脉证或阴寒凝滞证两证中的1种或两证均具备。本研究从微观角度分析冠心病痰阻心脉证或阴寒凝滞证患者对于薤白治疗敏感的机制，并从血小板表明膜蛋白表达情况初步分析薤白皂苷作用的受体和信号通路。

首先，本研究探讨冠心病寒痰阻滞证患者的血小板对于薤白皂苷的敏感性是否存在，观察薤白皂苷离体环境给药对ADP诱导的冠心病寒痰阻滞证血小板聚集的抑制作用。本研究结果显示，薤白皂苷中浓度、高浓度可显著抑制ADP诱导的血小板聚集，并呈浓度依赖性。

血小板表面受体主要包括酪氨酸激酶受体、整合素家族、七层跨膜受体、C型凝集素受体家族、Leucine-Rich Repeat家族[6]。P-选择素(CD62p)属于C型凝集素受体家族，是最早参与和体现血小板活化的重要标志物之一。在静息状态下，血小板表面表达的CD62p较少，多数的CD62p存在于血小板内α颗粒膜上；当血小板活化形变后，α颗粒膜与血小板膜融合，CD62p即表达于血小板膜上，所以CD62p是最具代表性的血小板活化标志物，是血小板功能检测的“金标准”[7]。本研究结果显示，薤白皂苷显著抑制ADP诱导后的血小板活化。

GPIIb/IIIa是纤维蛋白原受体，在静息状态下纤维蛋白原受体位点未暴露，血液中纤维蛋白原不能与其结合，血小板活化后构型改变，GPIIb/IIIa暴露出纤原识别位点并与纤原结合，通过这种方式血小板互相连接、聚集[8]。GPIIb/IIIa是血小板聚集的最终共同通路。阿昔单抗、替罗非班就是通过拮抗GPIIb/IIIa受体位点来抑制血小板聚集[9]。本研究结果显示，薤白皂苷可通过GPIIb/IIIa信号通路对血小板活化进行影响，所以薤白皂苷可能通过此信号通路影响血小板聚集。

血小板膜上有2种ADP受体，分别是P2Y1和P2Y12。P2Y1偶联Gq蛋白，激活磷脂酶C，通过増加血小板胞浆内钙离子浓度，诱导血小板聚集；P2Y12偶联Gi蛋白，抑制腺巧酸环化酶活性，引起血小板聚集。2个受体需一起才能诱导血小板活化，抑制其中一个受体，即可影响血小板聚集[10-11]。为分别研究薤白皂苷对这2种受体的作用，本研究用到了P2Y1受体括抗剂MRS2179和P2Y12受体括抗剂MRS2395，发现薤白皂苷分别作用于这2种受体进而抑制血小板聚集。

综上所述，薤白皂苷对于痰阻心脉证和阴寒凝滞证者ADP诱导的血小板聚集有更好的抑制作用，其可能作用于P2Y1和P2Y12，通过降低胞浆内巧离子浓度和升高CAMP含量，抑制血小板聚集的效果。