甘蓝型油菜种子萌发期耐铝毒特性综合评价及其种质筛选

郜欢欢 叶 桑 王 倩 王刘艳 王瑞莉 陈柳依 唐章林 李加纳 周清元 崔 翠

西南大学农学与生物科技学院,重庆 400715

铝(Al)占地壳总含量7%,通常以难溶性铝氧化物和铝硅酸盐等结合态的形式存在[1-2]。但是,当土壤pH低于5.5时,结合态的铝会溶出铝离子(Al3+),对植物产生毒害作用[3-4]。全世界有30%～40%的耕地和70%的潜在耕地为酸性土壤[1,5-7]。近年来,随着铵肥大量施用及酸雨的影响,酸性土壤面积也呈现逐渐扩大的趋势[8-10]。种子萌发是植物生活周期中最重要和最脆弱的起始阶段[11]。马宝慧[12]研究2个耐性不同的水稻品种种子萌发生长对铝的耐性表明,当Al3+达到20 μmol L-1时显著抑制根系生长。李朝苏等[13]研究铝溶液浸种处理对2个荞麦品种萌发表明,低浓度铝(100 mg L-1)处理可促进种子萌发,5000 mg L-1铝处理降低了荞麦的发芽指数。Martins等[14]结果表明,高浓度铝严重限制了麻风树种子萌发和初始生长。陈建华等[15]发现不同浓度Al3+处理降低益母草种子发芽势和发芽率。胡萃等[16]研究发现高浓度Al3+处理对芝麻种子前期萌发产生一定抑制作用。李立等[17]研究表明,高浓度铝处理抑制香椿种子萌发,且浓度越高抑制作用越明显。胡锦勤等[18]研究认为高浓度的Al3+会降低发芽势,且显著抑制根系生长。可见铝毒是酸性土壤环境中影响种子萌发质量和幼苗形态建成的主要限制因素[19-21]。因此,选育萌发期耐铝毒胁迫的作物品种(系)是实现高产、提高品种稳定性的关键。

油菜是我国主要油料作物之一,在我国的种植面积及总产量均占世界的1/3[22],主要分布在南方酸性土壤的长江中下游流域。酸性土壤中铝损坏根系分生组织的细胞活性,抑制细胞有丝分裂和根系生长[23-24],影响水分及营养元素吸收[25],最终限制作物的生长和产量[26]。油菜适宜生长的土壤pH为6.0～7.0[27],铝毒害问题成为油菜生产的重要胁迫因子[27-28]。铝毒对油菜生长的影响及耐铝毒种质的筛选鉴定引起了广泛重视。但针对油菜铝毒耐性种质资源筛选的试验主要在苗期进行。党甲军等[3]以不同浓度A12(S04)318H2O对油菜幼苗期进行耐铝性筛选,发现25～100 μmol L-1微量铝浓度促进幼苗根系伸长生长,而浓度为800～1600 μmol L-1时根伸长生长受到严重抑制。熊洁等[29]用1 mmol L-1浓度的铝胁迫(AlCl3,pH 4.0)进行苗期耐铝性鉴定,通过聚类分析将23份油菜品种(系)划分为耐铝、中度耐铝及不耐铝3类。黄邦全等[30]通过根长和鲜重比较分析了不同Al3+浓度对油菜的影响,并对8份油菜品种(系)幼苗的耐铝性进行了综合评价。自1976年,Konzak等[31]通过溶液-滤纸法(the method of solution-paper)进行小麦、大麦、水稻、高粱、玉米、大豆等作物萌发过程铝毒耐性资源筛选后,该方法已经被广泛应用[18,32]。但是,根据种子萌发期相关性状进行油菜耐铝毒种质资源筛选却未见报道。本研究对广泛收集的具有不同遗传背景和来源的148份甘蓝型油菜品种(系)采用溶液-滤纸法在种子萌发过程进行铝胁迫处理,调查各性状,运用主成分、聚类分析和逐步回归分析等不同评价方法综合评价油菜种子萌发期耐铝毒特性,筛选出萌发期对铝毒耐性较强的甘蓝型油菜种质并优化评价体系,为酸性土壤区域油菜耐铝毒品种(系)选择和新品种(系)选育提供参考依据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试油菜种质资源

用于萌发期铝毒胁迫处理浓度筛选的材料为中双11(ZS11)和4个不同油菜品系(D011、D363、D016、D064)；用于资源筛选鉴定和综合评价体系构建的试验材料是从国内外高等学校、科研院所收集并整理的具有不同遗传背景和广泛地理来源的148份甘蓝型油菜种质,所有品种(系)均由重庆市油菜工程技术研究中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1 萌发期铝毒胁迫处理浓度的筛选 以遗传背景不同的5份甘蓝型油菜品种(系)为材料,选择大小均匀、籽粒饱满的种子,以蒸馏水清洗3次。试验设置AlCl3的质量浓度分别为0(CK)、30、60、90、120、150和240 μg mL-1。在铺有2层滤纸的培养皿中均匀放入20粒种子,分别加入3 mL不同浓度的铝毒溶液。各处理3次重复。将培养皿置于光照培养箱中,温度25℃,相对湿度85%,光暗时间为16 h/8 h。植物根系对铝毒非常敏感[33-34],铝毒胁迫下根系生长快速受到抑制[35],通常将根长受抑制的程度作为植物铝毒耐性的筛选指标[36]。因此,本试验于7 d后测定其胚根长度,参考Foy等[37]的方法进行油菜种子适宜铝毒耐性处理浓度的筛选。

1.2.2 萌发期耐铝毒油菜品种(系)的鉴定 用筛选出来的胁迫浓度分别处理148份甘蓝型油菜种子,以蒸馏水处理为对照,按照上述培养方法,3次重复。以胚根突破种皮1 mm为发芽标准[38],于第3天和第7天分别统计发芽势(germination vigor,GV)和发芽率(germination rate,GR),第7天于每皿随机选取10株长势基本一致的幼苗测定植株根长(root length,RL)、芽长(shoot length,SL)、鲜重(fresh weight,FW)及干重(dry weight,DW)。

1.3 数据处理与分析

利用Microsoft Excel 2007统计、处理原始数据并作相关图表,运用SPSS 17.0[39]和DPS 2005[40]对处理后的数据进行方差分析、相关性分析、主成分分析及聚类分析等。

参考田蕾等[41]、姜奇彦等[42]方法,按照公式(1)计算各单项指标性状的铝毒耐性系数(aluminum toxicity tolerance coefficient,AC),计算各单项指标性状AC值间相关性、统计频次分布并进行主成分分析[43]；公式(2)和(3)分别用于计算各品种(系)各单项指标隶属函数和平均隶属函数值(average subordinate function value,ASF)；公式(4)和(5)分别计算各综合指标的权重(ωi)和铝毒耐性综合评价值(aluminum toxicity tolerance value,A)；公式(6)、(7)、(8)分别计算关联系数(ξi)、关联度(γi)和各指标权重系数[ωi(γ)]；公式(9)计算各品种(系)每个指标性状的对铝毒加权耐性系数(weight aluminum toxicity tolerance coefficient,WACij)；公式(10)计算每个品种(系)的对铝毒加权耐性系数(WACj)。

式(1)中,Xij、CKij分别表示第j个品种(系)第i个指标在铝毒胁迫和对照处理的测定值；m和n分别代表性状指标数和品种(系)数。式(2)中,ACij表示第j个品种(系)第i个指标的单项铝毒耐性系数,ACmin、ACmax分别表示所有参试材料某单项指标耐性系数的最小值和最大值。式(3)中,Ri表示每个品种(系)的第i个指标的隶属函数值。式(4)中,ωi表示第i个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重；Pi代表经主成分分析所得到各品种(系)第i个综合指标的贡献率。式(5)中,R(Xi)代表各主成分得分值；其中k为选取的主成分个数。式(6)中,ξi为关联系数,Δij为品种(系)最优性状与第j个品种(系)第i个指标的绝对差值,minΔij为最小二级绝对差值,maxΔij为最大二级绝对差值,p为分辨系数(取0.5)；式(7)中,γi为关联度；式(8)中,ωi(γ)为各指标权重系数；式(9)中,WACij为第j个品种(系)第i个指标的加权耐性系数,ACij表示第j个品种(系)第i个指标的单项铝毒耐性系数；式(10)中,WACj为第j个品种(系)的加权耐性系数。

以各指标铝毒耐性系数(AC)为比较序列,以铝毒耐性综合评价值(A)为参考序列进行灰色关联度分析,获得各指标AC 值与A 值间的关联度(γi)。基于A 值采用类平均法和欧氏距离进行聚类分析。以A 值为因变量,对各指标的AC 值为自变量进行逐步回归分析,获得回归方程。

2 结果与分析

2.1 胁迫浓度筛选

在不同浓度铝毒胁迫处理下,5 个品种(系)胚根生长均受到抑制(表1),但不同品种(系)的根长在不同铝胁迫浓度下变化趋势存在差异。当处理浓度为30 μg mL-1时,5 个品种(系)根长较对照差异均未达到显著,而当处理浓度大于或等于120 μg mL-1时,5个品种(系)根长较对照差异均达到显著水平,且随着浓度增加,抑制更加明显。因此铝毒胁迫浓度过低(≤30 μg mL-1)或者过高(≥120 μg mL-1)均无法区分品种(系)间耐性差异。在60 μg mL-1和90 μg mL-1铝毒胁迫时,ZS11 和D363 根长较对照差异显著,而D011、D016 和D064 与对照差异不显著,说明这2个浓度能够区分出品种(系)间耐性差异,可用于区分油菜种子萌发期耐铝性差异的筛选浓度。为了提高选择效率,实验中选择用90 μg mL-1铝胁迫浓度作为筛选萌发期耐铝毒油菜品种(系)的适宜处理浓度。

2.2 萌发期指标分析

由表2可知,6 个性状在对照和处理2 种条件下品种(系)间差异均达到显著水平。对照组中各性状变异系数范围为24.79%～30.52%,变异系数从大到小依次为发芽势、根长、干重、芽长、鲜重、发芽率；处理组中各性状变异系数范围是 24.49%～32.96%,变异系数从大到小依次为干重、根长、发芽势、鲜重、发芽率、芽长。对照和处理2 种条件下变异系数均大于24%,说明148 份油菜品种(系)间具有较广泛的遗传变异。铝毒胁迫下,根长均值、鲜重均值及干重均值较对照分别下降 32.36%、15.60%和4.26%,其中根系受抑制最为严重；而发芽势、芽长、发芽率则分别较对照增加5.81%、4.86%和4.53%。

表1 各品种(系)不同铝毒胁迫浓度下根长变化 Table1 Changes of root length of different varieties under different aluminum toxicity stress concentrations(cm)

表2 铝毒胁迫下油菜品种(系)各指标的变化 Table2 Changes of various indexes of rapeseed varieties under aluminum toxicity stress

2.3 单项指标铝毒耐性系数(AC 值)分析

按照公式(1)计算148 份油菜品种(系)的单项指标铝毒耐性系数(AC 值),统计该群体各单项耐铝毒系数(AC 值)的频次分布(图1),结果表明,各指标AC 值连续性变异分布,具典型的数量性状特点,直接通过AC 值大小区分品种(系)铝毒耐性较为片面。表3表明,鲜重、干重和根长AC 值均值小于1.00,而发芽势、发芽率和芽长 AC 值均值大于1.00。但6 个单项指标铝毒耐性系数(AC 值)在品种(系)间差异较大,均达到极显著水平(P＜0.01),说明这些性状在铝毒胁迫下不同品种(系)间变化不同。6 个指标的变异系数介于12.650%～36.528%之间,表现为根长＞发芽势＞发芽率＞鲜重＞芽长＞干重。表4表明,各指标铝毒耐性系数之间存在一定程度的相关性。其中,根长与发芽率、鲜重呈极显著正相关(P＜0.01),与芽长呈显著相关(P＜0.05)；而芽长与鲜重,发芽势与发芽率,干重与鲜重之间均呈极显著正相关(P＜0.01)。因此,各性状的铝毒耐性系数所提供的信息重叠,在油菜耐铝毒胁迫中所起的作用不完全相同,直接利用这些性状指标的AC 值进行油菜萌发期耐铝毒性评价不太准确,较为片面。

图1 甘蓝型油菜不同指标耐性系数的频次分布 Fig.1 Frequency distribution of tolerance coefficients of different indicators in Brassica napus

表3 油菜各指标铝毒胁迫耐性系数(AC 值)Table3 Aluminum toxicity stress tolerance coefficient of each index of rapeseed(AC value)

表4 油菜各指标铝毒胁迫耐性系数相关系数 Table4 Correlation coefficients of aluminum toxicity stress tolerance coefficient among various indexes of rapeseed

2.4 单项指标耐性系数(AC 值)的主成分分析

由表5可知,第一、第二、第三和第四主成分的贡献率分别为 33.418%、29.522%、14.747%和12.723%,累计贡献率达到90.411%。抽取前4 个主成分因子,基本涵盖了所测指标的大部分遗传信息,将6 个单项指标转化为4 个新的相互独立的综合指标,作为铝毒胁迫影响油菜种质萌发期的主要筛选指标。第一主成分中发芽势、发芽率和根长正向贡献率较高,第二主成分中鲜重、干重和根长正向贡献率较高,第三主成分贡献率较高的是芽长,综合可知,主成分一、二、三基本包括了萌发期测定的所有指标性状,且贡献率达到77%以上,所以前3 个主成分可反映148 份甘蓝型油菜萌发期耐铝毒性。

2.5 基于平均隶属函数值、铝毒耐性综合评价值和对铝毒加权耐性系数的综合评价

根据公式(4)计算供试148 份种质的平均隶属函数值(ASF 值),并排序(表6)表明,平均隶属函数值(ASF 值)介于0.109～0.642 之间,从大到小前10 名依次为01188、WH-20、甲预31 棚、A109、WH-55、中双10 号、WH-19、SWU110、沪油15 号和中油589,从小到大后10 名依次为湘油13 号、96021、CY12QSZ06、甲922、阳光198、SWU59、甲预17棚、WX10329、2012-3448 和WX1025。供试种质对铝毒耐性综合评价值(A 值)度量了各品种(系)的主成分得分和主成分权重的累加值,其值大小反应了各品种(系)对铝毒耐性的强弱。148 份油菜种质A 值介于-1.536～2.018 之间,根据A 值大小对供试种质进行耐性排序(表6),对铝毒耐性强的品种(系)排序前10 的品种(系)依次为01188、WH-20、A109、甲预31 棚、SWU110、中双10 号、沪油15 号、WH-19、WH-55 和中油589,对铝毒敏感性的品种(系)依次为湘油13 号、阳光198、甲预17 棚、甲922、WX10329、96021、CY12QSZ06、wx1025、2012-3448 和SWU59。根据对铝毒加权耐性系数(WAC 值)大小对供试种质进行耐性排序(表6),对铝毒耐性强的品种(系)有WH-20、01188、甲预31 棚、A109、WH-55、SWU110、WH-19、中双10 号、中油589 和沪油15 号,对铝毒敏感性的品种(系)有湘油13 号、阳光198、甲预17 棚、96021 和甲922。从3种综合评价体系来看,148份品种(系)在不同评价体系中排名略有不同,但排名顺序差异不大,对铝毒耐性和对铝毒敏感性品种(系)的筛选结果基本一致。

表5 各综合指标的特征值、贡献率和主成分特征向量值 Table5 Characteristic value,contribution rate,and principal component characteristic value of each comprehensive index

表6 铝毒胁迫下油菜品种(系)资源的ASF 值、A 值、WAC 值排序 Table6 ASF value,A value,and WAC value sequence of rapeseed variety resources under aluminum toxicity stress

(续表6)

(续表6)

(续表6)

2.6 聚类分析

基于各品种(系)综合铝毒耐性系数值(A),通过离差平方和法进行系统聚类,在欧氏距离D=10.95处将148 份供试种质分为四大类(图2)。其中第Ⅰ类是耐铝毒性的品种(系),包括01188、WH-20、甲预31 棚、SWU110、中双10 号和沪油15 号等18 份,占12.16%,其中,13 份材料来自湖北,2 份来自重庆,其余3 份分别来自江苏、陕西和四川；第II 类是较耐铝毒性品种(系),包括SWU96、至尊、中油589、皖油29、SWU40、SWU71、中双12 号和广德8104等45 份,占30.41%,其中,21 份来自湖北,12 份来自重庆,5 份来自江苏,3 份来自四川,2 份来自陕西,青海和甘肃各占1 份；第III 类属于耐铝毒性一般的品种(系),包括DDI、宿84-6、WH-37、扬J6711 和Rucabo 等56 份,占37.84%,其中27 份来自湖北,12份来自江苏,7 份来自重庆,4 份来自甘肃,2 份来自湖南,3 份来自陕西,1 份来自四川；第IV 类属于铝毒敏感品种(系),包括湘油13 号、阳光198、甲预17 棚和甲922 等29 份,占19.59%,其中9 份来自湖北,7 份来自重庆,6 份来自湖南,3 份来自四川,2 份来自甘肃,江苏,1 份来自陕西。统计各类型单项铝毒耐性系数(AC)、综合耐铝毒性度量值(A)、对铝毒加权耐性系数(WAC)和平均隶属函数值(ASF)(表7)表明,除干重的AC 值在第II 类群略有降低外,各单项指标AC 值以及综合评价体系中的ASF 值、WAC值和A 值均随铝毒耐性级别降低而减小。

表7 供试油菜种质耐性评价指标的分级 Table7 Classification of evaluation index of rapeseed germplasm tolerance

图2 基于A 值的供试种质耐性系统聚类图 Fig.2 Cluster diagram of test germplasm tolerance system based on A value

2.7 萌发期耐铝毒性指标的筛选和回归方程构建

统计各单项指标AC 值与A 值的灰色关联度、权重和排序(表8)表明,关联度和权重大小依次为根长、鲜重、干重、芽长、发芽率、发芽势,虽然各关联度和权重系数差值较小,但是根长和鲜重排序靠前,结果与前面各指标对铝毒胁迫的敏感性基本吻合。为了进一步分析萌发期各单项指标耐铝毒系数(AC 值)与耐铝毒特性之间的关系,筛选出耐铝毒鉴定指标,建立耐铝毒评价的数学模型,进行耐铝毒性预测。以6 个各单项指标耐铝毒系数为自变量、以耐铝毒综合度量值A 值为因变量,进行逐步回归,构建最优回归方程：A = -4.86305507+0.5507091372X1+ 0.7123716750X2+0.8760485264X3+0.7832374352X5+ 2.0774041486X6(F=1408512.3071**,R2=0.99998)。公式中的X1、X2、X3、X5、X6分别代表发芽势、发芽率、鲜重、根长和芽长的AC 值。从最优回归方程知,除干重外,各单项指标的耐铝毒系数(AC 值)均与油菜萌发期耐铝毒特性显著相关,在油菜萌发期耐铝毒特性筛选上,可以参考这5 个指标。回归方程预测准确度高、效果较好。因此,在油菜萌发期测定其根长、芽长、鲜重、干重、发芽率和发芽势,并通过回归方程估算其A 值,可以初步判断种质的耐铝毒特性。

表8 供试油菜种质各指标AC 值与A 值的灰色关联度 Table8 Grey correlation degree between AC values and A values of various indexes of rape germplasm

3 讨论

铝毒耐性是指作物在铝毒胁迫时所表现出来的忍耐能力。不同基因型作物间的铝毒耐性差异在铝离子浓度过高或过低的情况下都会趋于不显著[32],因此,适宜的处理浓度对作物种质资源筛选非常重要。本试验设计了7 个铝离子处理浓度,用不同遗传来源的5 份品种(系)为试验材料,以根长作为选择指标[37],通过比较不同材料间根长变化差异,最终选择90 μg mL-1AlCl3的处理浓度作为148 份种质资源的铝毒耐性筛选浓度。该浓度与Rosado 等[32]和应小芳等[44]在麻风树和大豆中筛选出的适宜浓度基本一致,但与刘强等[45]在油菜种子萌发中研究结果存在着差异,究其原因,主要是试验过程中研究品种(系)群体大小、参考指标和统计时间不同所致。

本研究单项耐性系数结果显示,对铝毒胁迫敏感性最强的是根长,研究结果与前人报道的结果一致[35-36,46-48]。除根长外,干重、鲜重、芽长、发芽势、发芽率均受到不同程度的影响,且不同品种(系)不同性状指标受到的影响程度不同,说明通过单一性状对种子萌发期耐铝毒能力进行评价不稳定。随着对作物抗逆性研究的发展,主成分分析、平均隶属函数值法、模糊数学综合评价法和聚类分析等已在棉花[49]、花生[50]、柑橘[51]等作物抗逆性的筛选鉴定中得到广泛应用,灰色关联度可确定各指标耐性系数与综合评价指标A 值间的密切程度[52-53]。结合多种分析方法对油菜萌发期耐铝毒种质资源进行筛选与综合评价较为可靠,既可以避免了单一方法的片面性,又能揭示油菜萌发期相关性状与耐铝性的关系,进一步丰富了耐铝毒种质资源筛选工作的内容。本研究结合各评价指标对148 份供试材料的萌发期铝毒耐性进行单项指标和综合指标排序,并基于综合铝毒耐性系数值(A)进行聚类,将148 份种质铝毒耐性分为四大类。其中,铝毒耐性强的品种(系)包括01188、WH-20、A109、甲预31 棚等,这些材料为油菜种子萌发期铝毒耐性机制和新品种选育提供材料,也为油菜栽培提供理论指导。通过不同地理来源的油菜品种(系)在聚类分析类群分布来看,陕西、甘肃和青海等偏北省份收集的15 份品种(系)中仅有5 份铝毒耐性较强,其余10 份铝毒耐性较差,究其原因可能是北方酸性土壤较少,铝毒害不严重；而耐铝毒性最好的18份油菜品种(系)主要来自湖北、重庆等南方地区,尤其是长江流域地区,由于该区域酸雨严重及铵肥大量施用,导致油菜生产长期遭受铝毒胁迫的为害,然而,适度的逆境胁迫能够提高植物的抗逆性,进化选择及适应性驯化使得该区域部分油菜品种表现出极强的耐铝性。

目前,油菜耐铝毒特性的研究主要在苗期和成株期,对油菜种子萌发过程中的研究较少。由于基因表达的时空性,作物在不同生育时期所表现的耐铝毒特性可能存在一定差异,在萌发期筛选出的铝毒耐性较好的油菜品种(系)是否在苗期或者成株期表现出相同的特性还有待于验证。从生育时期重要性来看,种子萌发是作物生长发育的初始阶段,其好坏影响作物生长发育的整个时期,因此筛选萌发期铝毒耐性较好的品种(系)具有非常重要的意义。本文通过单项指标和综合指标比较,认为综合铝毒耐性系数值(A)较单项指标更可以作为甘蓝型油菜种子萌发期铝毒耐性筛选的重要指标,并建立最优回归模型,认为该模型将可用于其他甘蓝型油菜种子萌发期铝毒耐性筛选。

4 结论

测定甘蓝型油菜萌发期相关形态指标,结合各指标铝毒胁迫耐性系数(AC 值)、各品种(系)铝毒胁迫耐性综合评价值(A 值)、平均隶属函数值(ASF 值)及各品种(系)的对铝毒加权耐性系数(WAC 值)进行相关分析、频数分析、主成分分析、灰色关联分析和聚类分析的评价结果基本一致。根据主成分、ASF值、A 值、WAC 值和聚类分析对148 份甘蓝型油菜铝毒耐性排序和分类,筛选出01188、WH-20、甲预31棚等为耐铝毒型品种(系)。通过灰色关联分析和逐步回归分析,并构建了最优回归方程：A= -4.86305507+ 0.5507091372X1+0.7123716750X2+0.8760485264X3+ 0.7832374352X5+2.0774041486X6(F=1408512.3071**,R2= 0.99998),认为测定发芽势、发芽率、鲜重、根长和芽长的AC 值可快速有效鉴定萌发期甘蓝型油菜种质资源对铝毒的耐性。