油菜农杆菌介导转化体系的优化

张姗姗，耿思宇，徐培林，王景雪

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.中山大学教育部基因工程重点实验室，广东广州510275）

油菜是我国重要的经济作物，油菜籽油是我国主要的食用油之一，油菜籽榨油后的饼粕是较好的动物饲料，但是在生产中由于菜籽油中含有一定的芥子苷等有害物质，限制了油菜饼粕的利用。因此，油菜的遗传改良尤为重要。在油菜的遗传改良中，建立农杆菌介导的油菜高效转化体系是进行油菜重要功能基因解析、遗传改良的必要条件。

农杆菌介导转化法是油菜转基因研究中最常用的转化方法。以往的研究发现，带柄子叶[1]和下胚轴[2-3]是最常用的外植体；共培养时间对转化效率有显著影响，且共培养时间与基因型有关[4-7]。外植体与农杆菌共培养的时间过短或过长，都不利于获得较高的转化率。尤其是当外植体与农杆菌共培养时间过长时，外植体会出现严重褐化甚至死亡，显著地降低了转化率。与其他植物相比，油菜属于难于进行遗传转化的物种，其在油菜遗传转化中存在着转化率低，转化过程中外植体易褐化死亡等问题。为解决这些问题，研究者对油菜遗传转化条件进行了优化。

有研究发现，农杆菌侵染外植体前，对外植体进行预培养，向分化培养基中加入AgNO3等都可以提高油菜的转化率[8-9]。即使是难再生的Brassica rapa，通过向培养基中加入乙烯抑制剂如氨乙氧基乙烯基甘氨酸（aminoethoxyvinylglycine）和硝酸银等，也获得了再生苗[10-13]。一些研究表明，硝酸银对于苗充分再生是专性的[14-15]，尤其当选择标记为卡那霉素时[16]。但是，AgNO3的浓度也不能过高，过高的Ag2+会对植物产生毒害。以往研究表明，在共培养前，外植体在愈伤诱导培养基上进行一定时间的预培养能够显著增加转化率[17-20]。GONG 等[21]研究发现，AgNO3会诱导芥菜细胞中再生相关基因的表达。有研究表明，48 h 是农杆菌介导转化体系的最佳共培养时间[22]。李韩帅等[23]研究发现，农杆菌菌液OD600为0.9～1.2 是玉米农杆菌介导转化体系的最适浓度。

为了更加系统地对农杆菌介导的油菜基因转化体系进行优化，本试验全方位、系统地研究了农杆菌介导转化中预培养时间、农杆菌侵染浓度、培养基中添加AgNO3的浓度和共培养基pH 值等对农杆菌转化中抗性芽苗分化的影响，以期获得优化的农杆菌介导的油菜转化体系。

1 材料和方法

1.1 试验材料和试剂

供试甘蓝型油菜（Brassica napus L.）为湘油15 号，其种子由湖南农业大学油料研究所提供。

供试质粒为pGRA1300，质粒图谱如图1 所示。质粒pGRA1300 的宿主菌为农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404；培养基中的无机盐和维生素均为分析纯级；固化剂琼脂粉购于鼎国生物工程有限公司；用于植物培养的氨基酸和植物激素均购于Sigma 公司。

1.2 试验方法

以湘油15 号为试验材料，对影响农杆菌转化的各种因素进行单因素分析。除了所研究因素不同外，其他操作均按下述农杆菌转化程序进行。

1.2.1 转化方法 将5～6 d 苗龄的无菌苗下胚轴切成约0.5～1.0 cm 的切段或带0.3 cm 左右子叶柄的子叶切下，置于MS＋2 mg/L 6-BA 培养基上分别进行2 d 的预培养，然后用OD600为0.4 的菌液侵染5 min。之后用无菌滤纸吸干外植体上多余的菌液。将外植体放置在MS＋2 mg/L 6-BA 培养基上共培养2 d。然后将外植体放入含有300 mg/L Cef 的无菌水中冲洗2～3 次。洗掉附着在表面的菌体，放入MS＋3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L GA3＋20 μmol/L AgNO3＋8 mg/L 草甘膦＋300 mg/L Cef 培养基中诱导愈伤组织分化和芽苗再生。20 d 后用原培养基继代一次。外植体分化出小芽后，转入新的筛选培养基中使小芽继续生长。待分化出的小芽苗长到3 cm 左右时，将小芽苗从外植体上切下，放入生根培养基中诱导生根。

1.2.2 农杆菌转化条件的优化 （1）预培养时间。将下胚轴或子叶外植体，在MS＋2 mg/L 6-BA 培养基上分别进行0，1，2，3，4 d 的预培养。（2）农杆菌转化菌液浓度。将预培养过的下胚轴和子叶外植体，分别用OD600为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 的菌液侵染5 min。（3）诱导培养基中添加AgNO3的浓度。将转化过的外植体，分别放在加有AgNO3浓度为0，10，20，30，40 μmol/L 的MS＋3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L GA3＋20 μmol/L AgNO3＋8 mg/L 草甘膦＋300 mg/L Cef 培养基上诱导愈伤组织和芽苗分化。（4）共培养基pH 值。将感染过的下胚轴或子叶外植体，分别置于pH 值为5.0，5.2，5.4，5.8 培养基上共培养2 d。之后，按照上述转化程序进行转化。转化后40 d 时，统计不同处理条件下外植体的出愈率和抗性芽苗分化率。

所有的试验处理均为3 次重复，所有的外植体培养均为（25±1）℃，光照周期为16 h 光照/8 h 黑暗。转化后筛选剂为草甘膦，抗性芽苗分化阶段筛选压为8 mg/L 草甘膦。

2 结果与分析

2.1 外植体预培养对抗性芽苗分化的影响

子叶和下胚轴外植体在不同预培养时间下的出愈率和抗性芽苗分化率列于表1。不同预培养时间下外植体愈伤组织生长和抗性芽苗分化情况如图2、图3 所示。

表1 预培养时间对抗性芽苗分化的影响 %

从表1 和图2、图3-A 可以看出，预培养对于高效率转化非常重要，预培养3 d 无论是对子叶外植体还是对下胚轴外植体，其出愈率和抗性芽苗分化率都是最高的，子叶和下胚轴的抗性芽苗最高分化率分别为23.77%和20.59%。因此，外植体在农杆菌侵染和共培养前进行3 d 预培养有利于获得较高的转化效率。

2.2 不同AgNO3 浓度对抗性芽苗分化的影响

外植体经与农杆菌共培养后，置于附加有不同浓度AgNO3的分化培养基上培养42～56 d 后，在外植体上诱导出抗性芽苗；当添加0～30 μmol/L AgNO3时，抗性芽苗分化率随着AgNO3浓度的增加而提高；但是当AgNO3浓度超过30 μmol/L 时，芽苗分化率会有所降低（图3-B）。说明向培养基中添加AgNO3虽然可以提高抗性芽苗分化率，但是过高的AgNO3会对植物抗性芽苗的分化产生不利影响。在本试验条件下，在基因转化中AgNO3的最佳使用浓度为30 μmol/L。此时，添加AgNO3的处理分别比不添加的处理，子叶和下胚轴的抗性芽苗分化率分别提高19.34，17.96 百分点（图3-B）。

2.3 农杆菌侵染的菌液OD600 对抗性芽苗分化的影响

通过对油菜农杆菌转化后外植体生长发育的观察发现，造成油菜基因转化中转化率低的主要原因是在油菜外植体经过农杆菌侵染和与农杆菌共培养后外植体上会出现严重的褐化现象。而且外植体褐化的程度与农杆菌侵染时农杆菌菌液浓度有关。在农杆菌侵染时间为5 min 时，用不同浓度的农杆菌菌液转化后，外植体的出愈率和抗性芽苗的分化率列于表2。由表2 可知，农杆菌菌液浓度对转化率有显著影响，当农杆菌菌液OD600为1.0 时，子叶外植体的出愈率和抗性芽苗的分化率分别比菌液OD600为0.4 时下降34.69，15.38 百分点；下胚轴外植体的出愈率和抗性芽苗的分化率分别比菌液OD600为0.4 时下降26.15，13.39 百分点。从图3-C可以看出，过高和过低的菌液浓度都不利于获得高转化效率，在本试验中，无论子叶还是下胚轴，芽苗的最大分化率均是在农杆菌菌液OD600为0.4 时得到的，此时子叶和下胚轴的分化率分别为23.00%和18.95%。因此，在农杆菌介导的油菜基因转化中，当侵染时间为5 min 时，最佳的农杆菌菌液OD600为0.4。

表2 农杆菌侵染浓度对抗性芽苗分化的影响 %

2.4 共培养基pH 值对抗性芽苗分化的影响

从图3-D 可以看出，共培养基pH 值5.4 时，抗性芽苗的分化率最高；共培养基pH 值为5.0 和5.2时，外植体上褐化比较严重，可能是由于较低的共培养基pH 值有利于农杆菌的生长。观察发现，共培养基pH 值为5.4 时，外植体上愈伤组织的生长状态优于其他3 种培养基上的愈伤组织，愈伤组织致密性较好；子叶和下胚轴外植体在共培养基pH 值为5.4 时，抗性芽苗分化率分别比共培养基pH 值为5.8 时提高9.97，6.18 百分点。

3 结论与讨论

本研究结果发现，外植体在农杆菌侵染前进行一定时间的预培养，农杆菌侵染及共培养后向诱导培养基中加入一定量AgNO3，可以提高油菜转化率，这与之前的研究结果相一致[24-26]。本研究还发现，优化农杆菌侵染的菌液浓度和共培养培养基的pH 值也可以提高油菜的基因转化率。有研究表明，植物进行离体培养时会产生乙烯，乙烯的积累会造成外植体的褐化。过高浓度的农杆菌侵染菌液也是造成外植体褐化的原因之一。AgNO3是乙烯的抑制剂，因此向农杆菌侵染后诱导培养基中添加30 μmol/L AgNO3，以及在农杆菌侵染时采用较低浓度的菌液侵染，可以减少油菜转基因中外植体离体培养时乙烯产生量，减少外植体褐化，促进抗性芽苗的分化[27]，农杆菌菌液浓度以OD600为0.4 时较好，这与何业华等[28]的研究结果相似。共培养基pH 值在油菜转化中的作用，前人很少研究。杨广东等[29]在大白菜上的研究认为，较低的共培养基pH 值（5.0）比较高的共培养基pH 值（5.8）诱芽率提高近2 倍。STACHEL 等[30]研究认为，pH 值在5.8 以上会使根癌农杆菌vir 基因处于不活化的状态。因此，较低的共培养基pH 值有利于vir 基因的诱导。TAKASAKI等[31]研究认为，pH 值为5.2 的共培养基比pH 值为5.8 的共培养基更有利于获得较高的转化率。本研究结果认为，共培养基pH 值为5.4 有利于油菜农杆菌介导转化后抗性芽苗的分化。不同植物的最适预培养时间不同，任伟等[32]研究表明，紫花苜蓿在农杆菌侵染前，预培养3 d 效果最好。

本试验结果表明，优化的油菜农杆菌介导转化体系为：外植体在农杆菌侵染前进行2～3 d 预培养、培养基中添加30 μmol/L AgNO3、农杆菌侵染的菌液OD600为0.4、侵染5 min、共培养基的pH 值为5.4。