刺山柑总生物碱对系统性硬皮病HGF/C-Met通路的调控作用*

康小龙，何承辉，卢 军

(1.新疆医科大学附属中医医院药研室，乌鲁木齐 830000；2.新疆维吾尔自治区药物研究所药剂室，乌鲁木齐 830004)

系统性硬皮病(systemic sclerosis,SSc)是一种结缔组织疾病，临床表现为皮肤和内脏器官纤维化、免疫异常及血管病变[1-2]。刺山柑总生物碱系本课题组从新疆地产药材刺山柑中提取的有效成分，拟用于SSc的治疗。本实验观察了刺山柑总生物碱对SSc组织纤维化密切相关的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)/C-Met通路的调控作用，以探讨刺山柑总生物碱改善SSc组织纤维化的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 选取清洁级雌性BALB/c小鼠90只，平均体质量(22.1±1.9)g，购自新疆实验动物研究中心，合格证号：SCXK(新)2015-0027。

1.1.2药物 刺山柑药材：新疆麦迪森维药有限公司饮片厂，由新疆药物研究所何江研究员鉴别为正品；盐酸博莱霉素粉针剂：日本化药株式会社，批号430312；青霉胺片：上海信谊药厂，批号052130503。

1.1.3试剂 小鼠HGF ELISA试剂盒(批号201503)，购自美国R&D公司；小鼠C-Met ELISA试剂盒(批号J27030166)，购自武汉华美生物科技公司；二辛可宁酸蛋白定量试剂盒(批号20150223)，购自江苏碧云天生物技术研究所。HGF抗体、α-tubulin抗体，购自美国Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG-HRP，购自美国Cell Signaling公司。

1.1.4仪器 酶标仪(型号Multiskan Spectrum)、低温离心机(型号Multifuge X1R)，美国Thermo Fisher公司；Western blot设备(型号Mini-protean Tetra System)，美国Biorad公司。

1.2方法

1.2.1刺山柑总生物碱的提取 将晒干粉碎的刺山柑果实，加10倍体积量95%乙醇80 ℃水浴回流提取30 min，提取2次，过滤，滤液备用，两次的滤液减压浓缩至药材：药液(g/g)质量比为2∶1。提取物浓缩干燥后经紫外分光光度法(UV)测得刺山柑总生物碱水平为32.0%(w/w)，高效液相色谱法(HPLC)测得盐酸水苏碱水平为2.2%(w/w)。

1.2.2刺山柑总生物碱乳膏制备方法 在水浴中将白凡士林、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、月桂氮卓酮加热至90 ℃使其熔融，作为油相；水浴加热刺山柑总生物碱提取物浓缩液与甘油混合物，温度达到90 ℃时作为水相；乳化剂为在适量水中加入羟基苯甲酸乙酯、十二烷基硫酸钠，水浴加热使其溶解；当水相、油相温度降至85 ℃时，依次将水相和乳化剂加入油相中，边加边搅拌至乳化完全。

1.2.3小鼠SSc模型的建立及给药方法 90只BALB/c小鼠，分为对照组、SSc模型组、低(225 mg/kg)、中(450 mg/kg)、高(900 mg/kg)剂量刺山柑总生物碱组及青霉胺(125 mg/kg)组，每组15只，博莱霉素皮下注射法建立SSc模型[3-4]：将小鼠背部中央区被毛剃除，盐酸博莱霉素粉针剂用生理盐水配成浓度为300 μg/mL的药液，除对照组背部皮下注射生理盐水外，其余各组注射博莱霉素30 μg/d，注射4周后，刺山柑总生物碱乳膏外敷低、中、高刺山柑总生物碱组小鼠背部，青霉胺组还给予青霉胺灌胃，对照组和SSc模型组外敷不含药基质乳膏，每天1次，连续给药8周。

1.2.4Western blot检测小鼠皮肤组织HGF表达 给药8周后，取小鼠背部皮肤，加入预冷的RIPA裂解液，组织匀浆机研磨成组织匀浆，冰浴裂解30 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，二辛可宁酸试剂盒定量上清液中蛋白水平，调整每孔上样量，使每个加样孔中总蛋白量相同，样品与上样缓冲液混合，95 ℃水浴中10 min变性蛋白，上样后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，Tris-HCl-Tween洗膜后，加入HGF一抗(按1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL发光剂显影，以α-tubulin作为内参，Image J软件扫描条带，比较蛋白相对表达水平。

1.2.5ELISA实验检测小鼠皮肤组织HGF和C-Met水平 给药8周后，取小鼠背部皮肤，加入生理盐水，组织匀浆机研磨成组织匀浆，4 000 r/min离心10 min后提取上清液。上清液中HGF和C-Met水平采用ELISA试剂盒测定，以每毫升上清液中总蛋白水平(二辛可宁酸蛋白定量试剂盒测定)浓度校正ELISA结果。

2 结 果

2.1各组小鼠皮肤组织HGF表达比较 Western blot结果显示，与对照组比较，SSc模型组小鼠皮肤组织HGF表达减弱(P<0.01)；与SSc模型组比较，中、高剂量刺山柑总生物碱组及青霉胺组小鼠皮肤组织HGF表达增强(P<0.05)，见图1。ELISA结果显示，与对照组比较，SSc模型组小鼠皮肤组织HGF水平明显降低(P<0.01)；与SSc模型组比较，中、高剂量刺山柑总生物碱组及青霉胺组HGF水平明显升高(P<0.05)；中、高剂量刺山柑总生物碱组及青霉胺组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

1:对照组；2:SSc模型组；3:低剂量刺山柑总生物碱组；4:中剂量刺山柑总生物碱组；5:高剂量刺山柑总生物碱组；6:青霉胺组；a:P<0.01，与对照组比较；b:P<0.05，与SSc模型组比较

图1各组小鼠皮肤组织HGF表达比较

2.2各组小鼠皮肤组织C-Met水平比较 与对照组比较，SSc模型组小鼠皮肤组织C-Met水平明显降低(P<0.01)；与SSc模型组比较，中、高剂量刺山柑总生物碱组及青霉胺组小鼠皮肤组织C-Met水平升高(P<0.05)，中、高剂量刺山柑总生物碱组及青霉胺组之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组小鼠皮肤组织HGF及C-Met水平比较

a:P<0.01，与对照组比较；b:P<0.05，与SSc模型组比较

3 讨 论

SSc是一种表现为多组织炎症和纤维化的慢性自身免疫性疾病，目前认为SSc是由于过度活化的成纤维细胞合成胶原、纤维连接蛋白和糖胺聚糖等增多，细胞外基质沉积，引发组织纤维化[5-6]。

HGF主要由内皮细胞、间质成纤维细胞、肾小球系膜细胞等间质来源的细胞生成。HGF通过与细胞膜上特异性受体C-Met结合，激活下游信号通路后发挥其生物学作用，HGF是一种抗纤维化细胞因子，它通过抑制纤维化和促进血管生成，在修复受损的组织中起一定作用[7]。HGF通过抑制胶原生成，诱导成纤维细胞凋亡，降解细胞外基质等作用而发挥抗纤维化作用[8-9]。

在SSc的研究中表明HGF/C-Met通路具有明显的抗纤维化作用。IWASAKI等[10]证实转染HGF基因后紧皮型(TSK/+)小鼠的皮肤硬化得到明显改善；WU等[11]研究发现用人类HGF基因转染至经博来霉素处理过的小鼠，不仅可以阻止皮肤硬化和肺纤维化进程，而且能有效改善皮肤硬化症状；KAWAGUCHI等[12]证实HGF能抑制SSc成纤维细胞胶原产生；SHERRIFF等[13]也发现SSc成纤维细胞Ⅰ型胶原及结缔组织生长因子的合成可被HGF抑制；BOGATKEVICH等[14]研究发现美国非洲裔SSc患者支气管肺泡灌洗液、血清及体外肺成纤维细胞培养基中HGF浓度较白种人显著降低，且HGF诱导的成纤维细胞C-Met受体磷酸化水平在非洲裔SSc患者也明显低于白种人，推测这可能是美国的非洲裔SSc患者病情较重及预后差的原因，同时也表明HGF/C-Met与SSc病程密切相关。本研究也发现SSc模型组小鼠皮肤组织HGF和C-Met表达较对照组明显减少，中、高剂量刺山柑总生物碱组HGF和C-Met表达较对照组明显增多，而与青霉胺组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示刺山柑总生物碱对SSc HGF与C-Met水平的异常降低有一定升高作用，其作用与青霉胺相当。

综上所述，本实验发现刺山柑总生物碱可增加SSc小鼠皮肤组织HGF和C-Met表达，本课题组已经证实：给SSc小鼠外用刺山柑总生物碱乳膏后，小鼠皮肤、肺组织炎症和纤维化等病理改变得到改善[15]，增厚的真皮鳞状上皮变薄，并可下调皮肤组织羟脯氨酸及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达[15-16]，提示刺山柑总生物碱可能通过上调HGF/C-Met通路，抑制胶原生成，降解细胞外基质，改善SSc皮肤纤维化。