薄层液基细胞学联合细胞DNA定量分析技术在恶性胸腔积液诊断中的应用价值*

汪少华,李 丹,黄丛改,王洁琼,万 宇,昝 潇,杨 波,杨志惠△

(西南医科大学附属医院：1.病理科；2.肿瘤科,四川泸州 646000)

胸腔积液是许多疾病常见的临床体征，许多恶性胸腔积液(MPE)疾病早期发现和治疗能显著提高患者的生存率[1]。胸腔积液的细胞学检查目前被认为是获得诊断的首选和主要途径[2]。然而细胞学是一种高度依赖形态学的检查方法，需要经过严格培训和经验丰富的病理医生及高质量的制片技术。若病理医生诊断经验不足，或因长期阅片造成的视力疲劳等均会造成假阳性及假阴性[3-4]。 DNA定量分析技术(DNA-ICM)是一种建立在基因水平上新兴的全自动检查方法[5]。本研究旨在研究薄层液基细胞学(TCT)联合DNA-ICM技术来鉴别MPE，减少诊断过程中的人为误差，探讨MPE最佳的检测方法，为临床诊断和评估MPE提供依据,现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2016年7月至2018年6月在西南医科大学附属医院住院的678例胸腔积液患者为试验组，其中男372例，女306例，年龄16～91岁。269例MPE患者，其中男152例，女117例，年龄16～91岁，转移性腺癌208例，转移性鳞癌30例，大细胞癌7例，小细胞癌12例，间皮瘤6例，淋巴瘤4例，未分型2例。409例良性胸腔积液标本作为对照组，所有研究对象均经临床和病理诊断证实。每例患者胸腔积液标本均采用TCT和DNT-ICM检查。本研究所有研究对象均知情同意，并经过医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1制片及染色 取100 mL胸腔积液标本,离心机在室温下，以1 500 r/min 离心15 min，取沉淀进行复悬，应用新柏氏液基细胞保存，采用膜式薄层液基细胞学制片机(美国豪洛捷医疗技术公司)制片，每例制成2张薄层细胞学片，1张薄层细胞片行HE染色进行TCT检查，1张行 Feulgen DNA染色，全自动细胞 DNA图像定量分析系统 (厦门麦克奥迪医疗诊断有限公司) 作DNA定量分析。

1.2.2TCT诊断 由病理科有丰富细胞学诊断经验的职称为中级及以上医师完成TCT阅片及诊断，查找恶性肿瘤细胞。TCT诊断结果分4级，Ⅰ级：未查见恶性肿瘤细胞；Ⅱ级：查见异型细胞；Ⅲ级：查见可疑恶性肿瘤细胞；Ⅳ级：查见恶性肿瘤细胞(包括转移性癌和恶性间皮瘤等)。参照文献[6]以Ⅰ级定为阴性判断标准，Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级定为阳性。

1.2.3DNA-ICM诊断 由全自动细胞图像扫描分析系统对每例5 000个以上胸腔积液细胞核进行自动聚焦扫描处理[7]。该系统同时测定每个细胞核DNA的132个参数特征，自动对被检细胞进行分类和计数，自动打印DNA倍体分析直方图和细胞点阵分布图，主要通过测定染色体细胞核积分光密度(IOD)值来判断细胞核DNA的含量，并以二倍体细胞(G1/G0)DNA指数(DNA index，DI) 为1，正常细胞 DI 值多为1左右；当DI为2时，多为四倍体细胞(G2/M期)。DI为1.1～1.9和2.1～2.9的细胞被认为是异倍体细胞。当异倍体细胞DI在1.1～1.9形成峰值，或有3个以上的细胞DI≥2.5时，可作为DNA-ICM诊断MPE的阳性指征。通常将DNA-ICM诊断结果分为3级，Ⅰ级：正常标准，无明显异倍体细胞峰及异倍体细胞；Ⅱ级：可疑恶性标准，查见少量DNA倍体异常细胞 (1～2 个细胞，DI≥2.5)；Ⅲ级：恶性标准，查见大量DNA倍体异常细胞 (3个或 3个以上细胞，DI≥2.5) 及异倍体细胞峰。 其中DI≥2.5以上的标本玻片需经有经验的细胞病理学医生在显微镜下阅片，以防系统将深染杂质和拥挤重叠的细胞核误认为恶性细胞造成假阳性。 在统计学分析时将Ⅰ级定为阴性胸腔积液，Ⅱ级和Ⅲ级定为阳性胸腔积液。

1.3统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计数资料以率表示，比较采用χ2检验。以P<0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1TCT和DNA-ICM诊断结果比较 在TCT诊断结果为炎性胸腔积液、异型细胞、可疑恶性及恶性肿瘤对应的DNA倍体阳性率分别为7.2%、37.0%、47.6%、55.4%，见表1。

表1 TCT检查和DNA-ICM分析比较(n)

2.2TCT、DNA-ICM与临床病理结果比较 经临床和病理证实的269例MPE，TCT诊断为Ⅱ～Ⅳ级者214例，DNA-ICM发现少量异倍体细胞及以上152例。409例对照组胸腔积液标本中，TCT检测有62例假阳性，而DNA-ICM检测只有20例出现假阳性，见表2、图1～2。

2.3TCT与DNA-ICM诊断灵敏度及特异度的比较 TCT在MPE诊断中的总体灵敏度为79.6%，DNA-ICM的总体灵敏度为56.5%，差异有统计学意义(P<0.01)。TCT和DNA-ICM在MPE诊断中的特异度分别为84.8%、95.1%，DNA-ICM特异度虽然高于TCT，但两者差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4TCT或DNA-ICM与联合诊断的比较 TCT单独诊断灵敏度远高于DNA-ICM，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步比较，29例患者在TCT诊断良性积液，而DNA-ICM分析中出现DNA倍体异常细胞，TCT与DNA-ICM联合诊断灵敏度为90.0%，特异度为89.5%,联合诊断的特异度虽有所降低，但是灵敏度差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 TCT和DNA-ICM在MPE中检测中的灵敏度和特异度分析(n)

A：DNA指数直方图及散点图；B：细胞核图像及DI值；C：Feulgen DNA染色细胞形态(×200)

图1恶性胸腔积液标本DNA倍体检测

A：DNA指数直方图及散点图；B：细胞核图像及DI值；C：Feulgen DNA染色细胞形态(×200)

图2良性胸腔积液标本中DNA倍体检测

3 讨 论

临床上有胸腔积液的病例很多，为患者抽胸腔积液除了可减轻症状外，也可从细胞病理角度明确胸腔积液的性质。判断是恶性肿瘤还是其他非肿瘤性疾病引起的胸腔积液，是细胞病理学诊断的难点[6,8]。MPE的诊断方法有很多种，包括胸腔积液脱落细胞学检查、DNA倍体定量分析、影像学检查、肿瘤标志物检查、胸腔积液分子标记、胸腔镜活检等。其中，胸腔镜活检组织病理学是最准确的检查方法，被称为金标准[9-10]。细胞病理学检查是诊断胸腔积液最常用的经典检查方法，尤其是对于不能耐受胸腔镜等有创检查的患者。但是细胞学检查的灵敏度变化与细胞病理医生的经验、送检标本的质量，肿瘤的分型和分化程度有关。

DNA倍体定量分析是肿瘤早期检测中的重要一环，通过DNA倍体分析进行胸腔积液良恶性的诊断在国内外已有大量文献报道，在北美、欧洲已是常规临床检测方法之一[11-12]。细胞DNA定量分析目前大多数是采用流式细胞仪(FCM)或计算机图像分析仪(ICM)，但FCM的设备昂贵，必须制备单细胞悬液，操作更复杂，不适合基层医院开展。DNA-ICM分析通过全自动数码显微镜扫描标本玻片的每一个视野，全自动检测细胞内DNA的含量变化来判定细胞是否发生癌变，采用自主分析系统并使用具体数据作为描述肿瘤生物学和形态学的特点，可发现先于形态学改变的恶性细胞[13-14]。因此测定其细胞DNA含量可以作为临床诊断MPE的客观依据之一。

本研究发现，TCT检查的灵敏度高于DNA-ICM分析，但特异度低于DNA-ICM分析。TCT在MPE诊断中的灵敏度为79.6%、特异度为 84.8%，DNA-ICM分别为 56.5%、95.1%，灵敏度差异有统计学意义(P<0.01)。虽然相比TCT，DNA-ICM可以提供很多更客观的诊断信息，但是本研究发现DNA-ICM也有假阳性和假阴性，推测DNA-ICM出现假阳性的原因可能是少数炎性胸腔积液中的细胞可出现退变或核固缩，这些细胞在Feulgen染色时，可出现DI≥2.5的异倍体细胞。这时需要反复检查，并且结合TCT结果和免疫组织化学结果以鉴别炎性或MPE。DNA-ICM出现假阴性的原因主要是对成团的癌细胞不能识别，MPE中以转移性腺癌最为常见，腺癌细胞常聚集成团，DNA-ICM有时不能识别而造漏诊。

进一步研究分析发现如果TCT与DNA-ICM分析联合诊断，灵敏度可提高为 90.0%，特异度变为89.5%。实验表明，与单独TCT或DNA-ICM分析相比较，联合诊断可明显提高灵敏度，胸腔积液阳性检出率明显增多，但是特异度与单独DNA倍体分析有所降低。这一结果与在宫颈的研究报道一致[4,15]。另外，在对照组的良性胸腔积液中，TCT诊断11例异型细胞，18例可疑恶性肿瘤，33例恶性肿瘤，而DNA-ICM结果只有20例假阳性。而且在TCT诊断的402例炎性胸腔积液中DNA-ICM发现了29例阳性标本。这是因为细胞学诊断主要依赖细胞形态结构特点，TCT制片技术虽然成熟，但是因为胸腔积液不仅成分复杂，更重要的是正常间皮细胞在炎症等各种刺激因素的作用下可出现增生，甚至非典型增生，这些增生与的间皮与转移性癌，特别是高分化癌细胞在镜下，从形态学上细胞病理学医师很难鉴别。DNA-ICM通过检测细胞DNA含量变化来判定细胞是否发生癌变，不会受细胞形态改变的影响，因此联合诊断有利于MPE的早期准确诊断。

综上所述，DNA-ICM在胸腔积液的诊断中有效弥补了TCT诊断可能引起的漏诊和误诊。TCT联合DNA-ICM较单纯TCT或DNA-ICM在胸腔积液诊断方面具有更好的灵敏度和较高的特异度，可以减少TCT诊断中细胞病理医师的人为因素和DNA-ICM固有缺陷造成的漏诊和误诊，进一步保证胸腔积液诊断工作的质量，有较大的临床应用价值。