维生素预混料中生物素含量的试剂盒法验证

陈敏儿，黄启红，熊 娟，伍玲燕，黄璇莹，张云龙

(广东省测试分析研究所，广东 广州 51000)

1 原理

生物素是植物乳杆菌Lactobacillus plantarum 生长所必需的营养素，将样品提取液和生物素检测培养基加入包被有Lactobacillus plantarum 的微孔中，Lactobacillus plantarum 的生长与样品生物素的含量呈线性关系。添加生物素作为标准或者作为样品混合物，乳杆菌会一直生长直至生物素被消耗殆尽。培养一段时间后测定吸光度，根据生物素含量与吸光度的标准曲线计算出样品中生物素的含量。

2 测定方法

2.1 试剂和材料

微生物法定量检测生物素试剂盒(VitaFast)

氢氧化钠(广州化学试剂厂)

生物素标准品(中国药品生物制品检定所)

一次性无菌注射器(江南)

0.22μm无菌过滤器(Sartorius stedim)

2.2 仪器和设备

HWS26型电热恒温水浴锅(上海一恒)

BHC-1300ⅡA/B2生物洁净安全柜(苏州净化)

1900培养箱(BioCELL)

MK3酶标检测仪(Thermo)

JJ200B电子天平(G&G)

2.3 供试品溶液的制备：

称取1.000g维生素预混料到1000mL容量瓶中，加入约400mL蒸馏水，摇匀。用NaOH调整pH值到8.0±0.2。95℃水浴提取30分钟，其间振荡至少5次，迅速冷却到30℃以下。用无菌蒸馏水准确定容至刻度。取1mL溶液至一个50mL无菌离心管中,加无菌蒸馏水至40mL，然后摇匀。无菌过滤，根据浓度范围，在1.5mL(或2.0mL)无菌试管中进一步稀释。

2.4 培养基的制备

取出试剂盒中的培养基，打开瓶盖用镊子取出干燥剂，加入10mL无菌水(取自试剂盒)至生物素培养基瓶中。盖好培养基瓶，摇匀。水浴加热该瓶至95℃保持5min分钟，其间振荡至少2次，并确保瓶子封闭。迅速冷却至室温(30℃以下)。使用0.2μm无菌滤膜过滤培养基至无菌离心管中。

2.5 标准品溶液的的制备

打开试剂盒中的生物素标准品瓶，添加X mL(X=详见标准品瓶)无菌水(取自试剂盒)至标准品瓶中。盖上标准品瓶盖，摇匀稀释=标准品浓缩液。取6个无菌管(1.5～2.0mL)，并按照下列表格准备标准品溶液：

*样品提取稀释倍数1∶40已经包含在标准曲线中。

表1 标准曲线溶液制备

2.6 测定法

微孔板实验中必须使用无菌水稀释的无菌样品，无菌水取自试剂盒。

移液器先移取培养基，之后标准品或稀释的样品，如下：

-移取150μL生物素培养基至微孔中。

-移取150μL标准品或稀释的样品至指定的微孔中(用标准品或样品溶液冲洗移液器尖)。

-用粘合箔盖住板条或微孔：除去粘合箔上的保护层，将其平放在微孔条上，用手将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条。注意保证粘合箔和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分。

-在37℃黑暗条件下孵育44～48h。

测量：

-再次压紧粘合箔，将微孔板翻置在桌面上，在桌面平面上振荡，使微生物溶解在培养基中。

-将微孔板翻回如前置于桌面上，从右上角开始以对角线方向180°角轻扯下粘合箔，与此同时务必用另一只手按住放置在桌面上的微孔板，以防止因粘合箔与微孔板粘合过紧而在撕扯时带起微孔板。

-破坏微孔中液体表面的所有泡沫(可以用移液管尖或针状物)。

-用酶标仪610～630nm(或540～550nm)条件下读取吸光度。

计算：

在计算结果时使用拜发公司提供的配套的RIDA?SOFTWin软件。

判定检测结果有效：

-OD空白值

-OD标准5>0.6 OD

样品稀释倍数40已经包括在标准曲线中(详见质量保证书)。在下面的公式中，只需要考虑提取的进一步稀释倍数及不同的样品重量。

生物素(μg / 100g)=

3 方法验证

3.1 专属性

空白溶液的制备：不加样品，依2.3所述处理得相应的生物素空白溶液；

阴性样品溶液：选取不含添加生物素的样品，依2.3制备的阴性样品溶液；

供试品溶液：依2.3制备；

测定：按2.6所述测定法测定空白溶液和样品溶液的吸光度。

所得结果如下：

表2 专属性试验结果

3.2 线性

依2.5配制浓度为0.08μg/100mL，0.24μg/100mL，0.40μg/100mL，0.56μg/100mL，0.72μg/100mL的生物素标准品溶液，按2.6所述在630nm波长处测定，所得浓度与吸光度关系如下：

表3 线性试验标准曲线

3.3 精密度

3.3.1 重复性

依2.3的方法平行制备6份供试品溶液，分别测定供试品溶液中生物素的浓度，以所得的样品中生物素的浓度来计算RSD %。

所得结果如下：

表4 重复性试验结果

3.3.2 中间精密度

连续3日，每日分取同一批号的样品，由不同检测员按2所述方法测定生物素，以测得的样品中生物素的结果来计算相应的RSD。

表5 中间精密度试验结果

3.4 准确度

取已知生物素含量的样品1.000g，置离心管中，共取9份，3份为一组，分为A、B、C三组。各组对照品加入量与样品生物量之比分别约为0.8∶1,1∶1，1.2∶1。

A组：3份样品均同法处理，方法为：于样品中加入53.0μg生物素对照品(配制浓度为100μg/mL的生物素对照品溶液，加入此溶液0.530mL)，摇匀，依2.3处理，作为供试品溶液A。按2.6所述测定，计算回收率和RSD。

B组：3份样品均同法处理，方法为：于样品中加入66.0μg生物素对照品(配制浓度为100μg/mL的生物素对照品溶液，加入此溶液0.660mL)，摇匀，依2.3处理，作为供试品溶液B。按2.6所述测定，计算回收率和RSD。

C组：3份样品均同法处理，方法为：于样品中加入79.0μg生物素对照品(配制浓度为100μg/mL的生物素对照品溶液，加入此溶液0.790mL)，摇匀，依2.3处理，作为供试品溶液C。按2.6所述测定，计算回收率和RSD。

所得结果如下：

表6 准确度试验结果

备注：测得加入生物素的质量(μg)=测得总的生物素的质量(μg)-1.000g样品生物素的质量(μg)
回收率(%)=测得加入生物素的质量(μg)÷加入生物素的质量(μg)×100%

3.5 耐用性

取同一样品溶液，分别于0、1、2、3、5、8小时时测定，测得生物素含量(mg/100g)，计算RSD。

表7 耐用性试验结果

4 结论

本文选取维生素预混料为样品，参照《中国药典》2015版四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则，对生物素微生物试剂盒法进行方法学验证，验证实验中线性和专属性试验测试结果良好，重复性相对标准偏差(RSD)为2.57%，中间精密度RSD为1.73%，准确度试验中回收率在95%～110%之间，RSD分别达4.37%、4.99%、2.51%，耐用性RSD为2.13%，均符合指导原则中的要求(RSD≤6%，回收率在80%～115%之间)。结果表明，生物素试剂盒法准确，可靠，适合于该维生素预混料中生物素的检测要求。与生物素传统微生物法相比，生物素试剂盒法方便快捷，无需活化菌种及传代，省时省力，亦减少污染概率，更适合厂家用于监控产品质控。