抗药性木霉与原始木霉菌株抑菌活性差异

鲁海菊 谢欣悦 张海燕

摘要：以分离自黄瓜中的3株内生木霉（Trichoderma）（J1、J3、Y2菌株）为供试菌株，用含扑海因杀菌剂的PDA培养基筛选到4株抗药性菌株（PJ1-1、PJ1-2、PJ3、PY2）。测定其对枇杷根腐病病菌（Pestalotiopsis microspora）P3.1、P3.5、P3.6菌株、石榴枯萎病病菌（Ceratocystis fimbriata）SK菌株和万寿菊叶斑病病菌（Alternaria brassicicola）WJ1菌株的抑制活性。结果表明，3株抗药性木霉（PJ1-1、PJ1-2、PJ3）对供试的5株病原菌抑菌活性均高于其原始菌株（J1和J3），且抑菌率均高于50%;抗药性菌株PY2对枇杷根腐病病菌P3.5菌株和石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制率均极显著高于原始菌株（Y2），对其余3株病原菌的抑制率低于原始菌株。说明PJ1-1、PJ1-2、PJ3等3株抗药性木霉菌株与杀菌剂扑海因混配使用的前景广阔，此结论可以为枇杷根腐病、石榴枯萎病及万寿菊叶斑病绿色防控提供菌种资源和理论依据。

关键词：抗药性木霉;扑海因;抑制作用;枇杷根腐病;石榴枯萎病;万寿菊叶斑病

中图分类号： S432.4+4  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0083-04

自2000年以来，云南省蒙自市石榴枯萎病[1]、枇杷根腐病[2]、万寿菊叶斑病[3]发生普遍严重，亟需高效防治方法。石榴枯萎病和枇杷根腐病为土传病害，化学防治土传病害存在施药困难、成本高、容易引起残留及环境污染等问题。枇杷及石榴抗病育种工作目前相对滞后，在枇杷和石榴中寻找抗枇杷根腐病及石榴枯萎病的基因，成功培育出抗性品种，在短期内难以实现。目前看来，生物防治是一种经济有效的控制土传病害的方法。

木霉菌（Trichoderma）是当前最有效且有巨大开发价值及潜力的生防菌。对多种植物病原菌表现拮抗活性[4]，并可用来防治部分土传植物病害[5]。但是木霉生防制剂受田间不稳定因素的影响较大、缺乏抗药能力等缺陷，限制了其在生产中的应用[6]。木霉成功定殖于植物根际土壤及其植株中，是木霉菌剂发挥生防作用的前提条件。而农药残留是木霉成功定殖的限制因素之一。因此，筛选抗药性木霉菌株尤为重要。笔者从3株黄瓜内生木霉中，筛选获得4株抗扑海因化学杀菌剂的木霉。为弄清抗药性木霉的抑菌活性是否衰退，拟测定其对石榴枯萎病病菌、枇杷根腐病病菌和万寿菊叶斑病病菌的抑菌活性，以期为云南省蒙自市3种重要植物病害的绿色防控提供生防菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 J1、J3、Y2均为内生木霉菌株，分离自黄瓜的茎（J1和J3菌株）和叶（Y2菌株）。枇杷根腐病病菌（Pestalotiopsis microspora）（P3.1、P3.5、P3.6菌株）、石榴枯萎病病菌（Ceratocystis fimbriata）（SK菌株）、万寿菊叶斑病病菌（Alternaria brassicicola）（WJ1菌株）分别分离自枇杷根腐病病株根茎韧皮部、石榴枯萎病病株枝干木质部、万寿菊叶斑病病叶。置于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，简称PDA）培养基中低温（4 ℃）保存，保存于云南省红河学院生命科学与技术学院植物病理教学实验室。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基：马铃薯200.0 g、葡萄糖18.0 g、琼脂13.5 g、蒸馏水1 000.0 mL;PDA含药培养基：马铃薯200 g、葡萄糖18 g、扑海因100 mg、蒸馏水1 000 mL。上述培养基配好后均在121 ℃高压灭菌30 min。马铃薯购自农贸市场，葡萄糖、琼脂、扑海因均购自云南科仪化玻有限公司，试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 抗药性菌株筛选 PDA培养基高压灭菌后冷却至 45 ℃，加入100 mg/L扑海因后倒平板。将各供试木霉菌株在PDA培养基平板中，28 ℃恒温扩大培养5 d，在培养基同一半径周围，用打孔器取直径为5 mm的菌饼，接种至PDA含药平板中央。设3次重复，在28 ℃下恒温培养，接种不加药的PDA培养基为对照。第7天观察是否长菌落。

1.2.2 对峙培养 供试菌株扩大培养及打取菌饼方法同“1.2.1”节中的方法，采用对峙培养法[7]，将木霉与病菌两两组合，同时接种于无菌PDA平板（直径90 mm）中，2个接种点相距 45 mm，以不接种木霉菌株的PDA培养基作对照，设3次重复，在28 ℃条件下恒温培养，第7天测定病菌的菌落直径，计算其生长抑制率。

抑制率=[（dCK-dB）/dCK]×100%。

式中：dCK表示对照病菌菌落直径;dB表示处理病菌菌落直径。

1.2.3 数据统计 所有试验数据均采用SPSS 19.0统计软件Duncans多重比较法进行统计分析，计算处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 原始木霉与抗药性木霉菌株菌落特征

木霉菌J1、J3、Y2菌株经含扑海因杀菌剂PDA平板培养，获得4株抗药性木霉菌菌株，分别为PJ1-1、PJ1-2（J1的抗药性菌株）、PJ3（J3的抗药性菌株）、PY2（Y2的抗药性菌株），抗药性菌株比原始菌株的菌落颜色浅（图1）。

2.2 各供试木霉菌菌株对枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制作用

由表1可知，7个木霉菌株对枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制率差异极显著（P<0.01）。抗药性菌株PJ1-1、PJ1-2、PJ3对枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制率均高于57%，抑菌作用强于其原始菌株。抗药性菌株PY2对枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制率略低于其原始菌株。说明抗药性菌株PJ1-1、PJ1-2、PJ3对枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑菌活性未衰退。其中，PJ1-1和PJ1-2抗药性菌株完全覆蓋枇杷根腐病病菌P3.1菌株，其上长出大量分生孢子，重寄生作用明显强于原始菌株（图2）。

2.3 各供试木霉菌菌株对枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制作用

由表2可知，7个木霉菌菌株对枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制率差异极显著（P<0.01）。抗药性菌株PJ1-1、PJ1-2、PJ3对枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制率均高于50%，抑菌作用强于其原始菌株。抗药性菌株PY2对枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制率极显著高于其原始菌株（P<0.01）。说明抗药性菌株 PJ1-1、PJ1-2、PJ3、PY2对枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑菌活性未衰退。其中，PJ1-1抗药性菌株的菌落完全覆盖枇杷根腐病病菌P3.5菌株，其上长出大量分生孢子，重寄生作用明显强于原始菌株（图3）。

2.4 各供试木霉菌菌株对枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制作用

由表3可知，7个木霉菌菌株对枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制率差异极显著（P<0.01）。抗药性菌株PJ1-1、PJ1-2、PJ3对枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制率均高于60%，抑菌作用強于其原始菌株。抗药性菌株PY2对枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制率低于其原始菌株，但产孢能力增强（图4）。说明抗药性菌株PJ1-1、PJ1-2、PJ3对枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制活性未衰退。其中，抗药性菌株PJ1-1完全覆盖枇杷根腐病病菌P3.6菌株，其上长出大量分生孢子，重寄生作用明显强于其原始菌株（图4）。

2.5 各供试木霉菌菌株对石榴枯萎病病菌的抑菌作用

由表4可知，7个木霉菌菌株对石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制率差异极显著（P<0.01）。抗药性菌株PJ1-1、PJ1-2、PJ3的抑制率均高于71%，抑菌作用强于其原始菌株。抗药性菌株PY2菌株对石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制率极显著高于其原始菌株（P<0.01）。说明抗药性菌株 PJ1-1、PJ1-2、PJ3、PY2对石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制活性未衰退。其中，抗药性菌株PJ1-1、PJ1-2、PJ3的产孢能力有所下降（图5）。

2.6 各供试木霉菌菌株对万寿菊叶斑病病菌的抑菌作用

由表5可知，7个木霉菌菌株对万寿菊叶斑病病菌WJ1菌株均具有不同程度的抑制作用。抗药性菌株PJ1-1、PJ1-2、PJ3对万寿菊叶斑病病菌WJ1菌株的抑制率均高于62%，抑菌作用强于其原始菌株。抗药性菌株PY2对万寿菊叶斑病病菌WJ1菌株的抑制率极显著低于其原始菌株。说明抗药性菌株PJ1-1、PJ1-2、PJ3对万寿菊叶斑病病菌WJ1菌株的抑制活性未衰退。其中，PJ1-1和PJ1-2抗药性菌株完全覆盖万寿菊叶斑病病菌WJ1菌株，其上长出大量分生孢子，重寄生作用明显强于其原始菌株（图6）。

3 结论与讨论

抗药性木霉菌株PJ1-1、PJ1-2、PJ3对供试的5株病原菌抑菌活性均高于原始菌株J1和J3，其中，PJ1-1菌株完全覆盖病原菌，其上产生大量分生孢子。说明其具有极强的重寄生能力，生防前景广阔。前人曾研究获得抗腐霉利[8]、抗苯菌灵[7]、多菌灵[9-10]、速克灵[11-12]、能降解敌敌畏[13]、毒死蜱和甲胺磷[14]等的抗药性木霉菌菌株。但筛选获得抗扑海因的木霉菌菌株尚属首次。

我国化肥和农药过量施用现象较严重，由此引起环境污染和农产品质量安全等重大问题。农作物绿色防控的呼声越来越高。木霉与化学农药混配使用能大大降低化学农药施用量，有时还能发挥协同增效作用。例如，段银芝等研究发现，吡虫啉、咪唑乙烟酸、咪唑烟酸等3种农药能促进哈茨木霉菌菌丝生长及产孢[15]。田连生等报道，木霉菌剂与多菌灵混配防治灰霉病有协同增效作用[16]。任凤山等发现，木霉与几种杀菌剂混配能增强对苹果轮纹病的防治效果[17]。木霉菌 PJ1-1 菌株与扑海因混配施用， 防治石榴枯萎病、枇杷根腐病和万寿菊叶斑病是否具有协同增效作用，有待进一步研究。

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