腹膜假黏液瘤人源异种移植模型的研究进展

林育林，张 珏，杨智冉，李鑫宝，姬忠贺，许洪斌，彭 正，李 雁※

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院腹膜肿瘤外科 北京市肿瘤深部热疗和全身热疗技术培训基地，北京 100038；2.北京大学航天中心医院黏液瘤科，北京 100049； 3.解放军总医院普外科，北京 100853)

腹膜假黏液瘤(pseudomyxoma peritonei，PMP)是一种以黏液性腹水、腹膜多发种植灶、网膜饼及卵巢受累为典型特征的恶性肿瘤综合征，多由阑尾黏液性肿瘤破裂穿孔、瘤细胞及黏液腹腔再分布导致，少部分来源于卵巢、胃、结肠、脐尿管、胰腺等腹盆腔脏器的原发黏液性肿瘤[1-3]。腹膜表面肿瘤国际联盟将PMP定义为恶性肿瘤综合征，病理学将其分为无细胞性黏液、腹膜低级别黏液癌或播散性腹膜黏液腺瘤病(disseminated peritoneal adenomucinosis，DPAM)、腹膜高级别黏液癌或腹膜黏液癌(peritoneal mucinous carcinomatosis，PMCA)、腹膜高级别黏液癌伴印戒细胞或腹膜黏液癌伴印戒细胞(peritoneal mucinous carcinomatosis with signet ring cells，PMCA-S)4类[1]。目前，国际上推荐行肿瘤细胞减灭术+腹腔热灌注化疗治疗PMP，可显著延长PMP患者的总生存期[4-5]。黏液进行性聚积导致的肠梗阻、肿瘤侵袭以及持续性硬化导致的腹盆腔脏器粘连仍是PMP临床治疗亟待解决的难题。

研究PMP核心病理机制、进展规律及影响因素需要有适宜的实验动物模型，尤其是与临床病理过程完全相似的原位人源异种移植模型(patient derived xenograft model，PDX模型)。现就已构建PMP PDX模型的建立方法、主要特征及使用该模型开展的PMP致病机制和干预研究予以综述。

1 模型建立方法

最常用的PMP模型动物有BALB/c-nu/nu裸小鼠[4-5]、Ncr-Foxn1nu裸小鼠[6-7]、无胸腺瑞士裸小鼠[8]、CBH/rnu/rnu大鼠[9]和WAG/Rija大鼠[10]。常用模型建立方法包括开腹瘤块包埋法及瘤细胞悬液腹腔注射法。接种肿瘤多来源于术中获取的患者标本，使用针头等物理切割方法将标本剪切成27～500 mm3瘤块，动物全身麻醉后通过腹正中线切口将瘤块包埋于动物腹腔，之后用可吸收缝线逐层缝合切口[6-11]。亦有少数文献报道，采用MKN45、LS174T、CC531细胞系的瘤细胞悬液接种建立PMP动物模型[6,12]。另有研究采用瘤细胞悬液腹腔注射法用于动物模型的传代[7-8]。

此外，冻存肿瘤组织复苏接种法也有应用。Mavanur等[8]将约3 mL第4代PMP模型，加入等体积杜氏改良Eagle培养基、20%胎牛血清和10%二甲基亚砜中，制成瘤细胞悬液，以0.5 ℃/min的速率降温至-20 ℃，再以1 ℃/min的速率降温至-80 ℃冻存，6个月后解冻加入等体积磷酸盐缓冲液重悬，以每只裸小鼠1 mL的剂量腹腔注射建立模型，观察至第60天，模型黏液性腹水的发生率为40%(2/5)。Flatmark等[7]则将肿瘤组织在-196 ℃存放3～6个月，采用腹腔注射法成功建立PMP PDX模型，说明了肿瘤组织冻存再复苏接种建立PMP PDX模型的可行性。但是Mavanur等[8]不建议采用冻存肿瘤组织建立PMP动物模型进行干预治疗实验。各种PMP PDX模型的构建方法不同，见表1。

表1 PMP PDX模型的构建方法

PMP：腹膜假黏液瘤；PDX：人源异种移植模型；PMCA-I：腹膜黏液癌中间组织学特征；DPAM：播散性腹膜黏液腺瘤病；PMCA-S：腹膜黏液癌伴印戒细胞；NA：无资料；PBS：磷酸盐缓冲液

2 日常监测指标

实验动物的体重变化是监测动物一般状态的良好指标，也是观察肿瘤生长情况的客观参数。Mavanur等[8]认为，联合动态观察PMP动物模型的体重和腹围变化能间接反映动物肿瘤的负荷。当模型动物体重明显下降和(或)腹围明显增加时，肿瘤负荷高，动物进入与肿瘤患者临床晚期相似的阶段，可据此决定干预时机，并判断疗效。成瘤率及成瘤时间也是后续利用模型进行干预治疗的重要观察指标，测量体重的频率多为每周1次[8,13-14]。

3 PMP模型的肿瘤生物学特点

3.1成瘤周期及种植成功率 PMP PDX模型接种后成瘤周期较长、成瘤率较低。Mavanur等[8]建立了人阑尾黏液腺癌来源的PMP动物模型，种瘤后第8周观察到种瘤成功，成瘤率为12%(2/17)，其中低级别黏液性肿瘤种植成功率较低，实验技术及低级别黏液性肿瘤本身的生物学特征是导致成功率较低的可能因素。初代PDX模型构建成功的观察期可多达8个月，8周无法观察到大部分荷瘤动物的大体形态学变化。Chua等[11]建立了DPAM大鼠模型，接种肿瘤后3个月成瘤率为100%。Dohan等[10]建立了DPAM和PMCA动物模型，模型传代间隔时间由第1次的19.4周缩短到第5次的11.1周，DPAM模型成瘤率为40%～90%，PMCA模型成瘤率为80%～100%。上述PMP动物模型肿瘤生长缓慢的特点符合PMP的惰性发展病程，容易受到各种环境条件的影响，该特点是导致较难构建人源PMP动物模型的重要原因。

3.2大体形态学特点

3.2.1腹腔肿瘤播散程度评估 根据小动物解剖特点，将人腹膜癌指数评分优化形成实验性腹膜癌指数评分(experimental peritoneal cancer index score，ePCI)体系。ePCI是评估肿瘤腹腔播散的最常用指标，将动物腹部分为4个象限，每个象限可评0～5分：0分(无可见肿瘤)，1分(肿瘤直径≤0.5 cm)，2分(0.5 cm<肿瘤直径≤1.0 cm)，3分(1.0 cm<肿瘤直径≤2.0 cm)，4分(2.0 cm<肿瘤直径≤3.0 cm)，5分(肿瘤直径>3.0 cm)；4个象限分数的总和即为ePCI(0～20分)，ePCI结合肿瘤结节总数可用于评估肿瘤的播散程度[15-17]。

Shao等[18]在以上评分系统的基础上改进了每个区域的评分分级，使其更适于描述小鼠腹腔内肿瘤播散程度，将腹盆腔分为Ⅰ：左右横膈、剑突；Ⅱ： 肝、脾、胃、肾及附属韧带；Ⅲ：小肠、结肠、肠系膜及壁腹膜；Ⅳ：盆腔、泌尿生殖系统、直肠4个区域，见图1。每个区域病损大小(leisure size,LS )评分细则为，LS-0：无肉眼可见肿瘤结节；LS-1：肿瘤结节直径≤0.2 cm；LS-2：0.2 cm<肿瘤结节直径≤0.5 cm；LS-3：肿瘤结节直径>0.5 cm；并引入腹水评分：1分，总分：0～13分，见图1。

Ⅰ：左右横膈、剑突；Ⅱ：肝、脾、胃、肾及附属韧带；Ⅲ：小肠、结肠、肠系膜及壁腹膜；Ⅳ：盆腔、泌尿生殖系统、直肠；ePCI：实验性腹膜癌指数评分；LS：病损大小

图1 ePCI评分分区示意图

3.2.2肿瘤播散特点 PMP PDX模型大体病理学特点与人类PMP相似，均表现出腹腔肿瘤广泛播散及黏液性腹水。Flatmark等[7]采用开腹种植法建立了PMCA-Ⅰ病理类型的PMP裸小鼠模型，大体病理学表现为大小不一的固体黏液性肿瘤，黏附于腹膜及腹腔脏器浆膜层，肿瘤未侵犯脏器实质，未发现膈肌外广泛转移，见图2中A1、A2。Dohan等[10]建立的DPAM亚型无胸腺瑞士裸小鼠模型的腹腔种植特点与Flatmark等[7]结果相似。经数次传代，Flatmark等[7]发现，模型腹腔黏液性腹水比例逐渐升高而固体肿瘤逐渐减少，而Dohan等[10]的PMCA模型传代过程中未观察到类似现象。此外，从第6代开始，Flartmark等[7]通过腹腔注射黏液性腹水进行传代，该方法缩短了传代间隔时间和腹胀出现时间，且同代模型间肿瘤生长情况更均一。

Chua等[11]建立的DPAM病理分型的CBH/rnu/rnu大鼠模型的大体病理学表现为黏液性肿瘤广泛播散累及壁层和脏层腹膜，大量黏液性肿瘤聚积压迫小肠，导致部分性肠梗阻，见图2中B1、B2。

Mavanur等[8]对建立的PMCA病理分型CrTac:NCr-Foxn1nu裸小鼠模型的研究显示，腹腔注射法接种60 d后，不同模型间解剖结果较一致，均表现出明显腹围增加，大量黏液性肿瘤包绕腹腔脏器，肿瘤组织疏松粘连于脏器浆膜层，局部可见固体肿瘤组织侵犯脏器浆膜层，但未侵及脏器实质，无肿瘤突破膈肌及血行转移，见图2中C1、C2、C3。Kuracha等[9]建立了迄今唯一的PMCA-S分型的Crl:NU(NCr)-Foxn1nu裸小鼠模型，该病理分型是PMP病理分型分化及预后均最差的类型，但该模型同样无肿瘤侵犯脏器实质及膈肌外远处转移，见图2中D1、D2、D3[19]。

3.3组织病理学和分子病理学特点

3.3.1组织病理学特点 目前已建立的PMP动物模型涵盖腹膜表面肿瘤国际联盟提出的DPAM、PMCA和PMCA-S三种主要病理类型[1]。DPAM镜下可见大量黏液池中散在分布条索状或柱状黏液性上皮，细胞异型性不显著，核分裂不活跃，伴纤维组织间隔和轻微炎症反应[10-11]。PMCA分类中同样有大量黏液池，但黏液性上皮更丰富，瘤细胞轻度堆叠分层，核分裂活跃，细胞异型性显著高于DPAM。PMCA-S分型表现为黏液池中出现散在分布的印戒细胞，其余镜下表现与PMCA一致。PMP PDX模型的组织病理学表现与人类一致，但是也存在部分差异，Flatmark等[7]和Mavanur等[8]均观察到人类肿瘤组织黏液池间常见的纤维间隔在模型肿瘤组织中显著减少，而上皮性肿瘤组织相对人肿瘤组织更丰富。Mavanur等[8]认为，上述现象可能与荷瘤无胸腺裸小鼠T细胞调节纤维化功能缺失有关。

免疫组织化学检测模型肿瘤组织及人源肿瘤组织的蛋白表达情况表明，PDX模型的免疫组织化学结果与相应人源肿瘤的组织病理学特点一致，可认为构建的模型是PMP PDX模型。PMP PDX模型常用免疫组织化学指标及结果，见表2。

A1：腹腔非粘连性黏液性腹水，固体肿瘤为主，累及膀胱、肝门及小肠系膜(第4代)；A2：PMP模型腹腔大量固体肿瘤，黏附于肝门、后腹膜、膀胱(第0代)；B1、B2：黏液性肿瘤累及壁层和脏层腹膜，大量黏液性肿瘤聚积压迫小肠；C1：腹腔大量黏液性腹水(第58天)；C2：肿瘤粘连于肝脏、胆囊、胰腺、胃、十二指肠及脾脏形成团块(第58天)；C3：小肠及肠系膜表面肿瘤组织；D1：大量黏液性腹水致腹围明显增加；D2：肿瘤种植于脏器浆膜层；D3：PMCA-S模型腹腔播散与DPAM、PMCA类似，无肿瘤组织浸润脏器实质

图2 各PMP模型大体形态学表现[3，5-7]

3.3.2分子病理学特点 近年来，利用PMP模型进行的基因表达研究逐渐增多。Mavanur等[8]发现，阑尾黏液腺癌CrTac:NCr-Foxn1nu裸小鼠模型的10p23染色体D10S1173位点发生杂合性缺失，而人源肿瘤标本未发现；模型更丰富的腺上皮导致肿瘤DNA/正常DNA比值增高，因此模型更易检测到突变，但该研究未发现Kras基因突变。Dohan等[10]报道了DPAM瑞士裸小鼠模型与人源肿瘤均发生Kras基因p.G12V突变，p53基因功能完好。人类PMP最常见的突变基因是KRAS和GNAS，突变率分别为57%～100%和40%～77%[20-25]。

表2 PMP PDX模型常用免疫组织化学指标

PMP:腹膜假黏液瘤；PDX：人源异种移植模型；CK：细胞角质蛋白；CDX-2：尾型同源框转录因子2；CEA：癌胚抗原；CA199：糖类抗原199；MUC：黏蛋白；VILLIN：绒毛蛋白；pan-cytokeratin：广谱角蛋白；E-Cadherin：上皮钙黏素；+：阳性；-：阴性；a：两模型病理诊断均为PMCA-I；NA：无资料

4 PMP发病机制的研究

目前，PMP的发生发展机制尚不明确。PMP PDX模型的大体病理学、组织病理学、分子病理学表现与人类PMP相似，是研究PMP发病机制的理想平台。腹腔肿瘤新生血管形成有利于PMP的发生发展。Dohan等[10]通过主动脉内注射硫酸钡悬液(1 g/mL)及同工凝集素B4行血管造影，检测血管内皮细胞特定抗原，测量肠系膜上动脉血流速度，以观察腹腔脏器血管及肿瘤新生血管，直观展示PMP新生血管生成情况；血管造影显示，肠系膜上动脉下游形成大量曲折的新生血管，分布于腹腔内肿瘤周围。血管生成分析结果显示CD31、血管内皮钙黏素及结蛋白染色均阳性。多普勒超声动脉血流速度测量显示，荷瘤组裸小鼠肠系膜上动脉血流速度为控制对照组的2倍，腹主动脉血流速度仍保持稳定。该研究通过影像学、组织病理学和血流动力学检查，在动物水平展示了腹腔肿瘤周围大量源自肠系膜上动脉的新生血管，提示血管靶向药物可能为患者带来生存获益。

“腹膜-血浆屏障”与PMP肿瘤及基质细胞共同作用，形成特定的肿瘤微环境，目前对腹腔肿瘤微环境的相关研究较少。腹水中的趋化因子/细胞因子水平可在一定程度上反映腹腔特定的肿瘤微环境，临床上难以区分患者腹水肿瘤细胞及基质细胞对趋化因子/细胞因子水平的贡献比例。动物模型中，肿瘤细胞源自人体，而基质细胞源自小鼠，为趋化因子/细胞因子来源的研究提供了理想模型。Kuracha等[9]使用抗人细胞因子抗体分别检测PMP患者和PDX模型腹水中17种趋化因子/细胞因子水平，对人类和动物模型PMP微环境差异的研究均显示，除白细胞介素(interleukin，IL)-6、团粒蛋白、IL-8外，其余14种趋化因子/细胞因子水平的差异均无统计学意义，说明动物模型腹腔肿瘤微环境与人体类似。抗鼠细胞因子抗体再次检测显示，差异有统计学意义，但两者IL-6水平差异由897倍降至6.4倍，团粒蛋白和IL-8水平差异亦发生类似变化；不同抗体(抗人细胞因子抗体或抗鼠细胞因子抗体)检测细胞因子水平不同，可能由于上述细胞因子由人类和小鼠基质细胞共同产生，因此对不同来源抗体的反应不同；人类和小鼠血浆细胞因子水平均无异常提高，产生该现象的可能原因是腹腔内肿瘤微环境与循环系统之间存在未知的“间隔物”(腹膜-血浆屏障)，故推测腹腔内肿瘤微环境中趋化因子/细胞因子水平的升高可能与调节肿瘤-基质细胞间信息交流相关，但未对上述推测进行验证，肿瘤微环境与循环系统间趋化因子/细胞因子及其他小分子物质含量的区别是未来解释PMP发生发展的可能研究方向，“间隔物”提示PMP治疗应采取腹腔内治疗联合全身治疗的综合策略。

5 PMP模型的干预研究

PMP模型的大体病理学、组织病理学、免疫组织化学与瘤源患者的一致性较强，可较好地呈现疾病的临床病理特征，成为研究PMP的理想模型，常用于干预治疗研究包括黏液溶液研究、靶向治疗研究和抗炎药物应用研究等。

5.1黏液溶解研究 细胞外黏液大量聚积导致肠梗阻、腹腔脏器粘连及营养不良是PMP患者死亡的主要原因，也是PMP最重要的特征[26]。PMP肿瘤组织镜下常表现为大量黏液池及散布其中的黏液性上皮组织，黏蛋白/细胞比例可高达1 000 ∶1，黏液池成为肿瘤细胞的天然屏障，阻碍化疗药物及生物药物杀伤癌细胞。由此可见，有效溶解黏液既可缓解肠梗阻、降低手术难度，还可进一步暴露肿瘤细胞，提高对药物的敏感性。

应用不同黏液溶解药物溶解腹腔内黏蛋白，但均出现不同程度的不良事件。腹腔灌注7%碳酸氢钠溶液1 000 mL后出现临界碱中毒；减瘤术后用10%右旋葡萄糖溶液500 mL灌洗，出现高糖血症[血清葡萄糖>500 mg/dL(1 mg/dL=0.055 5 mmol/L)]，提示7%碳酸氢钠溶液和10%右旋葡萄糖溶液虽具备一定的黏液溶解作用，但确切疗效有待进一步实验证实[27-28]。Pillai等[29]对PMP黏液溶解的长期研究发现，糖苷键和二硫键是PMP黏蛋白分子内的主要连接结构，菠萝蛋白酶(Bromelain)可水解糖苷键，广泛用于水解大分子壳聚糖，而N-乙酰半胱氨酸可水解二硫键，用于溶解呼吸系统疾病黏液，据此成功在PMP裸大鼠模型上证实，治疗组接受300 mg/mL菠萝蛋白酶+4%N-乙酰半胱氨酸的最佳剂量方案(pH=7.0)治疗72 h后，腹腔黏液完全溶解，而TRIS缓冲液对照组黏液未发生降解，黏液质量因水和作用较接种前增加，此方案有望广泛应用于临床使患者获益。

5.2靶向治疗研究 当前，国际上认为PMP是一种区域进展性疾病，腹腔内特定的肿瘤微环境可能有助于PMP发生发展。因此，针对腹腔肿瘤微环境的各个要素研制靶向制剂是治疗PMP的可能方向。Dohan等[10]使用抗血管生成药贝伐珠单抗治疗PMP模型，单纯贝伐珠单抗治疗组的中位生存期较对照组显著延长(PMCA1：79.8 d比58.4 d，P<0.001；PMCA2：81.6 d比58.2 d)，血清血管内皮生长因子、胎盘生长因子、转化生长因子-β水平明显低于对照组；贝伐珠单抗联合肿瘤细胞减灭术组的疗效同样优于对照组，表现为血流速度较对照组和术前水平显著降低；血管造影显示，治疗后的裸小鼠肿瘤周围新生血管较治疗前规则分支减少；实验从动物体重、腹围、肿瘤新生血管情况、血清血管生成相关细胞因子水平多方面验证了抗血管生成类药物贝伐珠单抗治疗PMP的疗效，但未阐述贝伐珠单抗对肿瘤体积和质量的影响。

Dilly等[14]研究发现，PMP患者黏蛋白(mucin，MUC)2启动子活性调节相关的促分裂原活化的蛋白激酶表达上调，使用特异性促分裂原活化的胞外信号调节激酶1/2抑制剂RDEA119 50 mg/kg治疗PMP PDX模型显示，RDEA119治疗组腹腔内黏液性肿瘤重量显著低于磷酸盐缓冲液对照组(6.2 g比13.8 g,P<0.01)，肿瘤生长与药物剂量成反比；随后LS174T细胞系的研究表明，RDEA119通过减少胞外信号调节激酶1/2和p38蛋白质的磷酸化而发挥抑制MUC 2分泌作用。

缺氧诱导因子-1α是缺氧过程细胞应答或肿瘤发展的重要转录因子，肿瘤耗氧增加及血管异常造成缺氧微环境，可诱导支气管黏膜上皮缺氧诱导因子转录，进而结合于缺氧反应元件，激活MUC5AC基因表达。MUC2基因位于第11号染色体，邻近呼吸道黏液主要成分MUC5AC基因，Dilly等[30]认为，缺氧诱导因子可通过相同途径调控MUC2基因表达，并证实PMP肿瘤组织缺氧诱导因子-2α在缺氧微环境中的表达水平高于正常肠道组织；针对缺氧/缺氧诱导因子-1α通路，在PMP裸小鼠模型上采用缺氧诱导因子-2α抑制剂BAY 87-2243行长期治疗，治疗第28天取肿瘤组织行逆转录-聚合酶链反应结果显示，MUC2信使RNA及MUC 2表达量显著降低，MUC 2表达量与缺氧诱导因子-1α表达量呈正相关，且BAY 87-2243治疗组裸小鼠治疗后整体状态较磷酸盐缓冲液对照组体重更轻、腹围更小、腹腔肿瘤总重量更轻，治疗效果显著。

肿瘤细胞不仅与基质细胞相互作用，还与细胞外基质成分相作用。近年来，肿瘤学家逐渐认识到肿瘤微环境对肿瘤细胞生长和侵袭的重要性，并对肿瘤微环境相关靶向药物进行了研究，但肿瘤微环境对肿瘤生长、侵袭和转移的调节作用尚不清楚。

5.3抗炎药物应用研究 促炎细胞因子(如IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α)、多效性细胞因子(如IL-4、IL-13、IL-9)、细菌胞外产物(如脂多糖)、脂质介质(如血小板活化因子)等炎症介质可通过作用于炎症相关转录因子结合位点促进黏蛋白分泌[31]。常见的炎症相关转录因子结合位点包括激动蛋白结合位点(激活子蛋白-1、激活子蛋白-2)、核因子κB结合位点、糖皮质激素应答元件结合位点和cAMP结合位点。Choudry等[13]将PMP模型分为地塞米松组(2 mg/kg)和磷酸盐缓冲液对照组的研究发现，治疗36 d后，地塞米松治疗组裸小鼠腹腔肿瘤重量明显低于对照组[(6.72±0.17) g比(13.02±0.96) g，P=0.002]；地塞米松组腹围小于对照组[(23.4±0.63) cm比(30.1±1.2) cm，P=0.003]。由此可见，地塞米松可抑制MUC 2分泌；糖皮质激素直接作用于糖皮质激素应答元件结合位点，从而抑制MUC 2黏蛋白分泌，或通过抑制核因子κB或激活子蛋白-1转录，间接减少MUC 2分泌，是地塞米松抑制MUC 2分泌的可能机制。

6 小 结

PMP是侵袭性较低的恶性肿瘤，常浸润腹腔脏器浆膜层，实质浸润少见，腹腔内大量黏液性腹水聚积是最主要的治疗难题，黏液性腹水包裹肿瘤细胞，阻碍化疗药物对肿瘤细胞的直接杀伤作用；黏液逐渐硬化，压迫并粘连腹腔脏器，给实施完全肿瘤细胞减灭术带来困难。有效溶解腹腔内黏液后行肿瘤细胞减灭术+腹腔热灌注化疗，辅以化疗及抑制黏蛋白分泌的特定靶向药物，可杀伤肿瘤细胞、减少黏液分泌，同时改造腹腔内肿瘤微环境以控制肿瘤生长是针对PMP最有效的手术综合治疗策略。近年来，PMP PDX模型在溶解和抑制黏液分泌方面的研究进展揭示了PMP PDX模型腹腔内特定的肿瘤微环境，其大体病理学特征、组织病理学特征、分子病理学特征及临床特征均与临床PMP患者一致，性状稳定的PDX模型将有助于PMP发生、发展机制以及发展新型综合治疗策略的研究。