艾司洛尔对脓毒症急性肺损伤大鼠肺泡炎症因子及氧化应激蛋白的调控研究

(陕西省人民医院急诊内科,陕西 西安 710068)

脓毒症为感染引起的全身炎症反应综合征，通常进展速度快、患者预后差[1-2]。急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征是脓毒症患者早期容易发生的症状，也是脓毒症在临床上引起死亡的主要原因[3]。因此，探索急性肺损伤的相关分子参与机制及治疗对改善临床预后具有重要价值。炎症反应因子的异常，尤其是白细胞介素家族水平的异常与肺损伤的病理过程密切相关，也是药物治疗效果的参考[4]；氧化应激是氧化还原的失衡状态，主要是由NOX蛋白家族参与的，其水平异常也参与了多种病理过程的肺损伤[5]。艾司洛尔为β受体阻滞剂，在肺损伤的治疗过程中有积极的作用[6]，但目前尚未见到其对脓毒症急性肺损伤模型作用的报道。本文分析艾司洛尔对脓毒症急性肺损伤大鼠肺泡炎症因子及氧化应激蛋白的调控作用。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

清洁级雄性SD大鼠40只购自上海实验动物中心。将大鼠适应性饲养一周后随机分为4组：对照组、模型组、地塞米松组和艾司洛尔组，每组10只。对照组和模型组大鼠给予生理盐水(1 mL/kg)灌胃治疗，地塞米松组(地塞米松0.25 mg/kg)和艾司洛尔组(艾司洛尔5 mg/kg)大鼠给予相对应的药物灌胃，每日一次，连续6天。末次给药后对照组给予生理盐水尾静脉注射，其余各组给予内毒素(3 mg/kg)尾静脉注射造模。

1.2 试剂及仪器

艾司洛尔购自Sigma Aldrich公司；白细胞介素2(interleukin2，IL-2)和IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒购自R&D公司；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase2，NOX2)一抗购自Cell Signaling公司；NOX4一抗购自Santa Cruz公司；地塞米松购自Sigma Aldrich公司；其余试剂为市售分析纯。垂直电泳仪、转膜仪及凝胶成像仪均购自Bio Rad公司；酶标仪购自累杜公司；移液器及冷冻离心机购自Eppendorf公司。

1.3 肺功能指标分析

各组动物造模24 h后进行麻醉，开腹，用经肝素抗凝处理过的血气分析专用注射器腹主动脉采血1 mL用血气分析仪进行动脉血气分析，测定其氧分压。取各组大鼠血浆及支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)少许称重，溴甲酚氯法测定血浆及BALF蛋白含量，计算LPI(LPI=BALF蛋白含量/血浆蛋白含量)。

1.4 Blotting法检测相关蛋白

配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，以等量总蛋白进行上样，以90 V电压在浓缩胶中电泳。电泳30 min后把电压升高至120 V，当溴酚蓝染料达到底部边缘以后，停止电泳，取出蛋白凝胶。把凝胶上的蛋白在90V电压条件下电转到硝酸纤维素膜上。取出硝酸纤维素膜，放在100 g/L的脱脂奶粉中，室温条件孵育2 h。将一抗用磷酸盐缓冲液以1∶800稀释以后，与NC膜反应，反应条件为：4 ℃过夜。再将辣根过氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP)标记的二抗用磷酸盐缓冲液以1∶3 000稀释，于室温中孵育2 h。用电化学发光试剂盒显色，以Image Quant Las 4000 min拍照分析灰度值，计算蛋白的相对表达量。

1.5 统计分析

应用SPSS21.0统计软件进行分析。计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间存在差异再进行SNK-q检验进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 艾司洛尔对脓毒症急性肺损伤大鼠肺功能的影响分析

与对照组相比，模型组大鼠的肺功能指标呼吸频率、肺泡通透指数均明显升高(P<0.05)，PaO2明显降低(P<0.05)，而地塞米松组和艾司洛尔组的上述指标得到明显恢复(P<0.05)，且艾司洛尔组恢复更明显(P<0.05)，见表1。

表1 艾司洛尔对脓毒症急性肺损伤大鼠肺功能的影响分析

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与地塞米松组比较，cP<0.05(n=10)

2.2 艾司洛尔干预后肺泡炎症因子水平变化分析

与对照组相比，模型组大鼠的炎症因子IL-2及IL-6水平均明显升高(P<0.05)，而地塞米松组和艾司洛尔组的上述指标得到明显恢复(P<0.05)，且艾司洛尔组恢复更明显(P<0.05)，见表2。

2.3 艾司洛尔干预后肺泡氧化应激蛋白水平变化分析

与对照组相比，模型组大鼠的氧化应激蛋白NOX2及NOX4水平均明显升高(P<0.05)，而地塞米松组和艾司洛尔组的上述指标得到明显恢复(P<0.05)，且艾司洛尔组恢复更明显(P<0.05)，见图1。

表2 艾司洛尔干预后肺泡炎症因子水平变化分析

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与地塞米松组比较，cP<0.05

图1 艾司洛尔干预后肺泡氧化应激蛋白水平变化分析与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与地塞米松组比较，△P<0.05

3 讨 论

脓毒症是临床上的常见疾病，通常会引起急性肺损伤，给患者生存状态带来明显的不利影响。但目前关于脓毒症引起急性肺损伤的相关分子机制尚不明确，可能与血管内皮细胞的损伤有关。目前临床上对脓毒症急性肺损伤的治疗通常采用早期抗生素、中期糖皮质激素联合血管活性药物，但效果通常不佳。本研究在分析艾司洛尔对脓毒症急性肺损伤大鼠肺泡炎症因子及氧化应激蛋白的调控作用时发现与对照组相比，模型组大鼠的肺功能指标呼吸频率、肺泡通透指数均明显升高，PaO2明显降低，模型组大鼠的炎症因子IL-2和IL-6、NOX2及NOX4水平均明显升高；而地塞米松组和艾司洛尔组的上述指标得到明显恢复，且艾司洛尔组恢复更明显，提示艾司洛尔能显著改善脓毒症急性肺损伤，可能与其调控大鼠肺泡炎症因子及氧化应激蛋白的水平有关。

以往的研究发现白细胞介素水平与急性肺损伤及药物的治疗效果有关[7-8]。在分析香菇多糖对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用时发现香菇多糖通过抑制IL-6、IL-1β信号分子而发挥抗炎作用，对脓毒症诱导急性肺损伤有保护作用[9]。在分析骨髓间充质干细胞对急性肺损伤幼鼠炎症因子IL-1β、IL-10的影响时也证实用骨髓间充质干细胞干预后，急性肺损伤幼年鼠的肺组织损伤减轻，并且IL-1β、IL-10蛋白表达较模型组显著降低，提示骨髓间充质干细胞能够减轻急性肺损伤肺组织的炎症反应并参与了肺组织损伤的修复[10]。在分析人参皂苷预处理对急性肺损伤大鼠肿瘤坏死因子-α和IL-6及IL-10水平的影响时也发现人参皂苷可能通过上调IL-10的表达及下调IL-6的表达来保护大鼠的急性肺损伤[11]。在分析IL-1β与IL-18在急性肺损伤中的表达及临床意义时证实细胞凋亡是急性肺损伤患者的重要病理机制之一，急性肺损伤的发生发展和IL-1β与IL-18的参与有关[12]。本研究也发现模型组大鼠的炎症因子IL-2和IL-6水平均明显升高；而地塞米松组和艾司洛尔组的上述指标得到明显恢复，且艾司洛尔组恢复更明显，提示艾司洛尔能显著改善脓毒症急性肺损伤，可能与其调控大鼠肺泡炎症因子水平的机制有关。氧化应激也参与了肺损伤的病理学过程，且药物能够通过调控氧化应激的异常状态改善肺功能指标[13-14]。在分析脓毒症大鼠模型心肌组织和肺组织中活性氧含量与组织损伤、细胞凋亡的相关性研究中也发现脓毒症大鼠模型心肌组织和肺组织中反应氧自由基生成增多能够引起组织损伤以及细胞凋亡[15]。艾司洛尔联合米力农治疗脓毒症合并心功能不全的作用可能与其抑制机体炎症反应、降低血乳糖来发挥作用[16]，且艾司洛尔提高肺叶切除患者早期肺氧合功能也与其抑制机体的炎症反应机制有关[17]。艾司洛尔联合去甲肾上腺素治疗脓毒性休克患者心功能障碍和血流动力学异常也是通过抑制炎症反应实现的[18]。本研究中也发现艾司洛尔能降低模型组血清中炎症因子水平，提示其作用的机制也是与其调节炎症因子水平异常有关。本研究也发现模型组大鼠的NOX2及NOX4水平均明显升高；而地塞米松组和艾司洛尔组的上述指标得到明显恢复，且艾司洛尔组恢复更明显，提示艾司洛尔能显著改善脓毒症急性肺损伤，可能与其调控大鼠肺泡氧化应激蛋白的水平有关。

因此，艾司洛尔能显著改善脓毒症急性肺损伤，可能与其调控大鼠肺泡炎症因子及氧化应激蛋白的水平有关。