理气导滞法对慢传输型便秘小鼠结肠动力的促进作用

陈 霞, 温伟波, 张 鹏

(1.云南省中医医院,云南 昆明650021；2.云南省第一人民医院,云南 昆明650000)

慢传输型便秘是临床常见的顽固性功能性便秘,其特征是结肠推进力减弱,内容物通过减慢,病因至今尚不清楚［1］,导致治疗困难［2］。目前,由中胚层间充质细胞分化而来的Cajal 间质细胞,特别位于环行肌与纵行肌间隙中的,被证实是胃肠运动产生节律性慢波的主要起搏细胞［3］,大量研究也将其作为治疗慢传输型便秘的靶向目标。课题组前期经过长期临床实践,总结出治疗慢传输型便秘的理气导滞法［4］,动物实验发现该方法对肠道传输功能有明显改善作用［5］；本实验在此基础上,探讨其对慢传输型便秘小鼠结肠动力的促进作用。

1 材料

1.1 动物 健康成年清洁级昆明种雄性小鼠,体质量(21±2) g,由北京华埠生物科技股份有限公司提供,饲养于云南省中医医院中心实验室,动物实验设施使用许可证号SCXK(京) 2014-0004,于室温10 ～20 ℃、相对湿度50%～70%、清洁安静环境的条件下采用架式分笼养饲养,每天正常进食饮水。动物观察为开放式,照明、换气等条件控制在规定范围内,为了减少肠易激的影响,实验前分别进行7 d 环境适应期、5 d 生理盐水灌胃期。

1.2 试药 理气导滞法组方采用四逆散加陈皮、炒厚朴、黄芪、生白术、苦杏仁、火麻仁、全瓜蒌、槟榔,药材选用中药免煎颗粒剂(江阴天江药业有限公司,批号醋柴胡18072211、白 芍18082191、 炒 枳 壳18081371、 全 瓜 蒌18071411、陈 皮18061111、 炒 厚 朴18061051、 苦 杏 仁18091531、甘 草18071941、 火 麻 仁18070411、 郁 李 仁18060881、 黄 芪 18080041、 生 白 术 18091041、 槟 榔1609180),造模选用盐酸洛哌丁胺胶囊(西安杨森制药有限公司,批号160912319),阳性对照选用枸橼酸莫沙比利片(江苏豪森药业股份有限公司,批号160904),制成相应混悬液备用。

2 方法

2.1 分组 实验前将适应性饲养后的50 只小鼠按照随机数字法分为正常组、模型组、阳性对照组及理气导滞法组方高、低剂量组(根据人-小鼠等效剂量换算得出高剂量组,以及高剂量半量的低剂量组),每组10 只。各组小鼠在精神、活动、体质量、排便分布情况上无明显差异,具有可比性。

2.2 造模 参照文献［6］,采用阿片受体激动剂——盐酸洛哌丁胺胶囊建立慢传输型便秘小鼠模型。除正常组外,其余各组小鼠灌胃给予胶囊混悬液(10 mg/kg),连续3 d,其间正常进食饮水；正常组小鼠灌胃给予等体积生理盐水,以避免干扰。

2.3 给药 造模3 d 后,阳性组小鼠灌胃给予枸橼酸莫沙比利(2 mg/kg),理气导滞法组方高、低剂量组小鼠分别灌胃给予26、13 g/kg 方剂,正常组、模型组小鼠灌胃给予等体积生理盐水,造模、干预灌胃给药间隔30 min,连续4 d。其间正常进食饮水,每天监测体质量、精神、活动、排便情况。

2.4 指标检测 将小鼠放入铺有滤纸的鼠笼内,每笼放1只,每天定时收集并记录小鼠粪便频次、份量、质地、首次排便时间,电子天平称量24 h 粪便湿重,以及经电热恒温干燥箱干燥后的粪便干重,计算24 h 粪便干、湿重之差(24 h 粪便湿重-24 h 粪便干重) 以反映粪便含水量。

最后一次给药后小鼠禁食禁水24 h,取0.4 mL 活性炭混悬液模拟肠内容物灌胃,90 min 后颈椎脱臼法处死,迅速剖开腹腔,取出贲门至直肠末端的肠道,幽门处离断,观察胃排空程度,再轻轻将肠管置于托盘中拉直,在松弛状态下测量活性炭混悬液在肠道内推进的长度及肠道的全长,计算活性炭混悬液推进长度占肠道全长比例(炭末混悬液前端与幽门的距离/肠道总长度×100%) 以反映肠道传输功能。

每组随机选择5 只小鼠分离结肠组织,取升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠组织各约1.0 cm,光镜下观察全结肠改变,其中整个肌层包括平滑肌细胞、肌间丛神经节细胞等。然后,测定结肠肠肌丛Cajal 间质细胞CD117 表达、结肠Cajal 间质细胞c-kit 表达。

2.5 统计学分析 通过SPSS19.0 软件进行处理,数据用表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用秩和检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠一般情况 各组小鼠存活率均为100%,实验期间其进食饮水、精神活动、皮肤毛发均正常。表1 显示,模型组、阳性对照组及理气导滞法组方高、低剂量组小鼠体质量均显著大于正常组(P＜0.05),并且各组间无显著差异(P＞0.05)。

表1 理气导滞法对小鼠体质量的影响n=10）

表1 理气导滞法对小鼠体质量的影响n=10）

注：与正常组比较,*P＜0.05

组别 体质量/g正常组 20.91±0.64模型组 21.77±0.36*阳性对照组 21.49±0.51*理气导滞法组方高剂量组 21.59±0.66*理气导滞法组方低剂量组 21.74±0.56*

3.2 理气导滞法对小鼠粪便含水量的影响 由于各组数据方差不齐,不符合正态分布,故通过K-S 秩和检验进行分析。结果,正常组、模型组小鼠粪便含水量无显著差异(P＞0.05),阳性对照组、理气导滞法组小鼠其含水量与模型组比较亦然(P＞0.05)。

3.3 理气导滞法对小鼠胃肠动力的影响

3.3.1 胃排空 图1 显示,正常组、阳性对照组、理气导滞法组方高剂量组小鼠胃排空情况很好,理气导滞法组方低剂量组小鼠情况较好,模型组小鼠有大量潴留。

3.3.2 肠道传输功能 表2 显示,模型组小鼠肠推进距离显著短于正常组(P＜0.05),理气导滞法组方组小鼠其距离显著长于模型组(P＜0.01)。

图1 各组小鼠胃排空情况

表2 理气导滞法对小鼠肠道传输功能的影响（，n=10）

表2 理气导滞法对小鼠肠道传输功能的影响（，n=10）

注：与正常组比较,*P＜0.05；与模型组比较,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

组别 肠推进距离/cm正常组 58.18±13.02模型组 45.92±8.05*阳性对照组 59.40±13.58＃理气导滞法组方高剂量组 59.97±8.27＃＃理气导滞法组方低剂量组 61.80±19.24＃＃

3.4 理气导滞对小鼠结肠黏膜影响 图2 显示,与正常组比较,模型组、阳性对照组小鼠结肠黏膜呈轻度慢性炎症改变,理气导滞法组方组小鼠结肠黏膜炎症改变较少。

3.5 理气导滞法对小鼠结肠肠肌丛Cajal 间质细胞CD117的影响

3.5.1 免疫组化染色 图3 显示,模型组小鼠结肠c-kit标记的肠肌丛Cajal 间质细胞阳性表达较正常组明显减少,阳性对照组、理气导滞法组方组其阳性表达与模型组相比均有所升高。

图2 各组小鼠乙状结肠黏膜HE 染色（×100）

图3 各组小鼠Cajal 间质细胞免疫组化图（模型组×100，其他组×200）

3.5.2 细胞计数 表3 显示,模型组小鼠Cajal 间质细胞数较正常组显著降低(P＜0.05),理气导滞法组方高剂量组小鼠其数量与模型组比较显著升高(P＜0.05),而低剂量组无显著变化(P＞0.05)。

表3 理气导滞法对小鼠Cajal 间质细胞数的影响n=5）

表3 理气导滞法对小鼠Cajal 间质细胞数的影响n=5）

注：与正常组比较,*P＜0.05；与模型组比较,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

组别 Cajal 间质细胞/个正常组 27.00±12.93模型组 17.22±6.55*阳性对照组 34.44±19.77＃＃理气导滞法组方高剂量组 25.32±11.32＃理气导滞法组方低剂量组 22.24±11.72

3.6 理气导滞法对c-kit 相对表达量的影响 表4 显示,模型组c-kit 相对表达量较正常组显著升高(P＜0.05),理气导滞法组方高剂量组其相对表达量与模型组比较显著降低(P＜0.01),而低剂量组无显著变化(P＞0.05)。

表4 理气导滞法对c-kit 相对表达量的影响n=5）

表4 理气导滞法对c-kit 相对表达量的影响n=5）

注：与正常组比较,*P＜0.05；与模型组比较,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

组别 c-kit 相对表达量正常组 0.36±0.01模型组 1.56±0.38*阳性对照组 0.98±0.37＃理气导滞法组方高剂量组 0.77±0.46＃＃理气导滞法组方低剂量组 1.13±0.51

4 讨论

近年来流行病学调查显示,全球范围便秘发病率为0.7%～79%［7］,国内为3%～17%［8］,其中慢传输型便秘发病率高居各种便秘亚型之首［9］,其病因复杂不清,可靠有效的治疗方法仍然在探索中。中医认为,它属“便秘” 范畴,患者有“排便费力、便不尽感” 的特征,气滞贯穿病程始终,治疗时应从理气导滞入手,通过调整逆乱气机,消除肠道积滞,最终产生有效蠕动,缓解结肠动力不足。

理气导滞法组方由调畅气机经典方四逆散化裁而来,方中柴胡、芍药、陈皮疏肝理气,配伍枳实、厚朴、槟榔消积导滞,黄芪、白术健脾益气助运,火麻仁、苦杏仁、全瓜蒌清热润肠,佐甘草缓急和中,全方疏肝理气、消痞导滞、通补兼顾。现代研究发现,四逆散可明显促进胃肠动力［10-11］,其提取物具有增强胃肠动力的作用［12］,柴胡、枳实、白术、槟榔对肠道传输也有明显促进作用［13］,结合临床疗效推测理气导滞法能提高胃肠传输,上调Cajal 间质细胞功能,故构建慢传输型便秘小鼠模型。结果显示,理气导滞法能改善小鼠肠道传输能力,以高剂量组更明显,并且对粪便含水量未产生明显影响,提示该方法改善了小鼠便秘情况,对慢传输型便秘具有良好的治疗作用,而且不同于其他刺激性泻剂,该作用不是增加粪便水分,而是促进肠道蠕动来实现。

特异性标志物酪氨酸蛋白激酶受体c-kit (又名CD117)［14］可标示产生消化道慢波电位的“起搏点” ——Cajal 间质细胞,其数量和分布不同均可导致结肠运动功能紊乱。本实验采用免疫组化方法,用CD117 标记小鼠结肠Cajal 间质细胞,发现慢传输型便秘模型小鼠位于环行肌与纵行肌间隙中的CD117 标记Cajal 间质细胞数明显减少,而理气导滞法干预后其显著上调,以高剂量组更明显,表明理气导滞法治疗慢传输型便秘与增加结肠肠肌丛Cajal 间质细胞的数量密切相关。另外,造模后小鼠结肠c-kit 相对表达量明显升高,而理气导滞法干预后有所减低,以高剂量组更明显。结合Grabarek［15］对正常人骨髓干细胞表面c-kit受体表达随造血细胞发育成熟呈现变化的趋势提示,理气导滞法治疗慢传输型便秘可能与Cajal 间质细胞,特别是成熟者的数量密切相关。