六味葛蓝降脂片HPLC 指纹图谱建立及5 种成分测定

周雅琪, 蒋 林, 魏博伟, 李晓梅, 李芳婵, 随家宁, 郭勇秀

(广西中医药大学药学院,广西 南宁530001)

高脂血症为临床上的多发病及常见病,是引发脂肪肝、心脑血管疾病的重要病因之一［1］,中医药在防治该疾病上具有独特优势,可多靶点、多环节综合降脂,而且毒副作用小,相关中药或保健食品市场前景良好［2-8］。

六味葛蓝降脂片是由广西中医药大学制药厂拟开发的具有辅助降血脂功效的保健食品,由绞股蓝、火麻仁、决明子、葛根、沙棘、荷叶6 味药食两用药材配伍而成,通过扶正祛邪、补中益气来调节机体代谢机能,从而达到降血脂作用［9-10］。方中葛根和决明子发挥主要作用,前者所含异黄酮是重要药效物质［11］,葛根素、大豆苷、大豆苷元等［12］具有扩张冠状动脉血管、增加冠状动脉血流量作用,同时可降血脂［13-14］；后者具有降血脂、降血压等疗效,可抑制血清胆固醇,以降血脂效果更显著［15-16］,其主要有效成分为蒽醌［17］,代表性成分有橙黄决明素、大黄酚,为泻下、降血脂作用的主要成分［18-19］。

本实验建立六味葛蓝降脂片HPLC 指纹图谱,并测定其中葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚的含有量,为完善该制剂质量标准提供依据。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪,配置UV 型紫外检测器；TGL-16G 离心机(上海安亭科学仪器厂)；KQ5200B 超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SQP 电子天平［百万分之一,赛多利斯科学仪器(北京) 有限公司］；超纯水(密思博超纯水机制备)。 六味葛蓝降脂片共10 批(批号20170501、20170601、20170602、20170603、20170701、20170801、 20170802、 20170803、 20170901、20171001),2 g/片,由广西中医药大学制药厂提供,原药材均购自广西玉林市祥生中药饮片有限责任公司,经广西中医药大学制药厂质量保证部专家鉴定为正品。葛根素对照品(170109,含有量＞98%,上海融禾医药科技有限公司)； 大豆苷(MUST-17092780, 含 有 量99.46%)、 大 豆 苷 元(MUST-17101202,含有量99.99%)、橙黄决明素(111900-201303, 含 有 量 99.1%)、 大 黄 酚(MUST-17041310,含有量99.50%) 对照品 (成都曼思特生物科技有限公司)。乙腈为色谱纯(美国Fisher 公司)；甲醇、磷酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Phenomenex Gemini C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相乙腈(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脱(0 ～8 min,15%A；8 ～20 min,30%A；20 ～40 min,55%A；40 ～45 min,60%A；45～55 min,70%A；55 ～60 min,85%A)；体积流量1.0 mL/min；检测波长280 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚对照品适量,甲醇分别制成1.210 0、0.750 0、0.635 0、0.570 0、0.315 0 mg/mL,取适量置于同一量瓶中,甲醇稀释,即得 (质量浓度分别为0.164 1、0.067 3、0.034 4、0.054 9、0.028 9 mg/mL),置于冰箱中贮存备用。

2.2.2 供试品溶液 取本品20 片,研细,精密称取约2 g,置于具塞锥形瓶中,精密加入20 mL 甲醇,称定质量,超声(200 W、40 kHz) 30 min,冷却至室温,甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,续滤液离心,取上清液,即得。

2.3 HPLC 指纹图谱建立

2.3.1 精密度试验 取供试品溶液 (批号20170501),在“2.1” 项色谱条件下进样测定6次,以7 号峰的保留时间和色谱峰面积为参照,测得其余11 个共有峰的相对保留时间RSD 在0.05%～0.24%之间,相对峰面积RSD 在0.89%～2.0%之间,表明仪器精密度良好,符合相关要求和规定。

2.3.2 稳定性试验 取供试品溶液 (批号20170501),于0、2、4、8、12、24 h 在 “2.1”项色谱条件下进样测定,以7 号峰保留时间和色谱峰面积为参照,测得其余11 个共有峰的相对保留时间RSD 在0.09%～1.1%之间,相对峰面积RSD在0.64%～2.0%之间,表明溶液在24 h 内稳定性良好,符合相关要求和规定。

2.3.3 重复性试验 取本品(批号20170501) 约2 g,按“2.2.2” 项下方法制备6 份供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,以7 号峰保留时间和色谱峰面积为参照,测得其余11 个共有峰的相对保留时间RSD 在0.10%～0.34%之间,相对峰面积RSD 在1.2%～1.9%之间,表明该方法重复性良好,符合相关要求和规定。

2.3.4 建立方法 取10 批样品,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,见图1,再通过“中药指纹图谱相似度评价软件” (2012.130723 版) 进行分析,平均数法生成对照图谱,多点校正法建立指纹图谱,见图2。共标示出12 个共有峰,由于7 号峰(大豆苷元) 保留时间适中,稳定性好,峰面积较大,故选择其作为参照峰(S)；10 批样品相似度均大于0.997,表明其质量相对稳定,共有成分基本一致,但含有量上有差异。

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

图2 共有峰HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of common peaks

2.3.5 主要特征峰归属 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,记录色谱图。结果,共指认出5 个特征峰(2、4、7、8、12 号),分别为葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚。

2.4 5 种成分含有量测定

2.4.1 系统适用性试验 取对照品、供试品、阴性对照溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图3。由图可知,对照品、供试品在相同保留时间处都有特征色谱峰, 而阴性对照未发现,拖尾因子均在0.95 ～1.05 之间,表明其他成分对测定无干扰, 理论塔板数以大豆苷元计为6 800。

图3 各成分HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液,甲醇稀释,制得含葛根素0.065 7、0.131 3、0.016 41、0.197 0、0.229 8、0.262 6 mg/mL,大豆苷0.026 9、0.053 8、0.067 3、0.080 7、0.094 2、0.107 6 mg/mL, 大 豆 苷 元0.013 8、 0.027 5、0.034 4、 0.041 3、 0.048 2、 0.010 76 mg/mL,橙黄决明素0.022 0、0.043 9、0.054 9、0.065 9、0.076 9、0.087 9 mg/mL,大黄酚0.011 6、0.023 2、0.028 9、0.034 7、0.040 5、0.046 3 mg/mL 的对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标 (X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度试验 取“2.2.1” 项下对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚峰面积RSD 分别为1.7%、1.6%、1.6%、1.7%、1.6%,表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取本品(批号20170501) 适量,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黄决明素、 大黄酚峰面积RSD 分别为1.3%、 1.1%、1.9%、1.9%、2.0%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 精密称取本品 (批号20170501)6 份,每份2.0 g,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚含有量RSD 分别为0.61%、1.4%、1.6%、1.6%、1.0%,表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 精密称取本品(批号20170501) 约1.0 g(葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚平均含有量分别为1.788 5、0.616 9、0.379 6、0.603 3、0.158 4 mg/g),共6份,分别精密加入葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黄决明素、 大黄酚对照品1.800 0、0.620 0、0.380 0、0.600 0、0.160 0 mg,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚平均加样回收率分别为 98.1%、 102.6%、 98.0%、 96.0%、 97.7%,RSD 分别为0.72%、1.1%、1.7%、0.54%、0.72%。

2.4.7 样品含有量测定 精密称取10 批片剂,每批约2 g,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算含有量,结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of content determination of various consti-tuents（mg/g，n=2）

3 讨论

本实验考察供试品溶液制备方法时,以甲醇、水、乙醇为提取溶剂,比较了超声、回流提取,以及提取时间、溶剂用量、提取次数对含有量测定的影响,发现在取样量2 g、甲醇20 mL、超声30 min条件下供试品溶液中5 种成分总含有量较高,分离度较好,而且操作简便。然后,采用二极管阵列检测器分析不同波长下色谱图,发现在280 nm处各成分较稳定,含有量较高,并与其他杂质峰达到良好的分离效果。

指纹图谱是一种具有整体性、模糊性、专属性等特点的质量控制和评价方法［20］,能全面呈现样品复杂性,近年来广泛应用于中药研究中［21］。本实验发现,10 批六味葛蓝降脂片HPLC 指纹图谱相似度均大于0.9,具有很好的一致性。另外,中药材有着多成分、多功效的特点,只对其单一成分或特征性成分进行研究无法全面控制其质量［22-24］,故本实验采用HPLC 法同时测定六味葛蓝降脂片中葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚含有量,发现其均存在一定差异,可能是由于药材种植、地域等因素所致。因此,控制药材源头、规范生产工艺是保证保健食品质量稳定的重要措施。

4 结论

本实验建立六味葛蓝降脂片HPLC 指纹图谱,并测定其中葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚的含有量,该方法简便、快速、准确,重复性好,专属性强,既考察了该制剂中多种有效成分的含有量,又通过指纹图谱整体相似度为其全面质量评价提供可靠依据。