异毛远盲蚓在Cd胁迫下五种酶类标志物的响应特点

武静慧 李永 魏源 杨晓进 张 一 胡清

摘要：分析了中国北方土壤广布种——异毛远盲蚓（Amynthas heterochaetus）在重金属污染物镉（Cd）胁迫下的半致死剂量（LC50）及与其免疫相关的5种酶类标志物在此过程中的活性变化，并与OECD推荐的标准蚯蚓种——赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）进行了比较研究。结果表明，Cd对异毛远盲蚓24和48 h的LC50（分别为11.23和5.17 μg/cm2）均小于赤子爱胜蚓（分别为21.99和16.95 μg/cm2）;低浓度Cd胁迫下，异毛远盲蚓体内SOD、GSH-PX、CAT、AchE、T-AOC的活性均发生了显著变化;与赤子爱胜蚓相比，异毛远盲蚓体内的酶类标志物响应快速（3 d）且持续时间较长（28 d）。

关键词：环境基准;蚯蚓;异毛远盲蚓（Amynthas heterochaetus）;Cd;酶类标志物

中图分类号：X174         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）12-0058-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.014           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Amynthas heterochaetus， a widely distributed soil species in northern China， was analyzed under heavy metal cadmium （Cd） stress at a semi-lethal dose （LC50）. The activities of Amynthas heterochaetus and its five immune-related enzyme markers under Cd stress were analyzed and compared with Eisenia fetida， a standard earthworm species recommended by OECD. The results showed that LC50 of Amynthas heterochaetus（respectively 11.23 and 5.17 μg/cm2） of Cd at 24 and 48 h was lower than Eisenia fetida（respectively 21.99 and 16.95 μg/cm2）. Under the low concentration of Cd stress， the activities of SOD， GSH-PX， CAT， AchE and T-AOC were significantly shifted， both in Amynthas heterochaetus and Eisenia fetida. Compared to Eisenia fetida， the response of enzymatic biomarkers in Amynthas heterochaetus were quicker （3 days） and lasted longer （28 days）.

Key words： environmental benchmark; earthworm; Amynthas heterochaetus; Cd; enzyme markers

土壤重金屬污染是指由于人类活动，致使土壤中重金属过量沉积，造成土壤环境中的重金属无法自然代谢而恶化的现象[1]。重金属污染的危害，除表现为对土壤生态结构和功能的稳定性的影响外，还表现为可以通过植物的根系进入食物链，间接威胁人体健康[2]。由于土壤重金属污染具有持久性、隐蔽性和不可逆性等特点，污染一旦产生，难以消除，且代价高昂[3]。因此，找出科学合理的土壤重金属含量限值，即土壤基准研究工作就显得尤为重要。常规的化学分析方法可以得到土壤中各种污染物的含量，但难以科学地反映各种有毒物质对土壤环境的综合影响和潜在风险，也不能全面评价土壤生态系统的健康状况。生态毒理诊断对于科学、全面地评价土壤污染状况有重要的补充作用，各种生物测试方法可对化学方法难以检测或鉴定的物质毒性效应及复合污染效应进行合理有效地评价，为重金属污染土壤的早期预警与安全评价提供依据。

蚯蚓作为土壤生态系统中的重要组成生物，被认为是土壤毒性评价中最重要的指示生物之一[4]。因此，经济合作与发展组织（Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD）[5，6]、国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）[7-11]，美国材料与试验协会（American Society for Testing Materials，ASTM）[12]等重要标准化组织都将蚯蚓列为重要的土壤指示生物之一，并提出了相应的研究方法。这些方法以经典生态毒理学研究方法为主，重点关注蚯蚓在污染物胁迫下的急性致死率、慢性致死率和生殖积累毒性等，以用于土壤环境质量基准值的制订。同时，利用酶类生物标志物表征环境污染程度也是近年来的重要研究方向之一，较之经典毒理学研究方法，具有试验周期短、响应灵敏的优点，但因其开展时间较短，尚需大量研究数据予以校正[13-15]。

现阶段，被OECD、ISO、ASTM等标准体系认可的蚯蚓有赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）和安德爱胜蚓（Eisenia andrei）两种。这两种蚯蚓虽然在国外试验研究中被广泛采用，但并非中国的本土优势种[16]，并不能反映中国自然生态系统的真实情况。远盲蚓属（Amynthas Kinberg，1867）蚯蚓在中国南北各地均有分布且数量较多，具有典型的生态代表性[16]，同时体型较大，便于采集和试验，具有成为中国本土土壤环境质量指示生物的潜力。因此，本研究参考了经济合作与发展组织推荐的化学品对蚯蚓急性毒性试验的标准方法，分析了中国北方土壤广布种——异毛远盲蚓（Amynthas heterochaetus）在重金属污染物Cd胁迫下的半致死剂量及与其免疫相关的5种酶类标志物在此过程中的活性变化，并与OECD推荐的标准蚯蚓种——赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）进行了比较研究。以期为中国本土土壤指示生物研究提供参考，为土壤环境质量标准制订工作提供依据[17]。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试生物  选用的蚯蚓品种是赤子爱胜蚓和异毛远盲蚓。赤子爱胜蚓主要生活在富含有机质的土壤中，生命周期短，在20 ℃的条件下，孵化需要3～4周，7～8周即可发育成熟;异毛远盲蚓为亚洲广布种，在中国境内的自然土壤中属常见品种，已发现在吉林、辽宁、河北、北京、安徽、福建、贵州、江苏、四川、浙江等地均有分布，其背面深棕色，略带紫色光泽，体长100～158 mm，宽3～5 mm，体节数92～120，背孔自12/13节间始，雄孔位于xviii节腹侧1平顶乳突上，受精囊孔4对，位于5/9节间腹侧[16]。

赤子爱胜蚓为实验室自行繁殖，试验选择3月龄以上、体重为300～600 mg、环带明显且大小相近的健康成蚓。

异毛远盲蚓由人工采集自北京斯凯兰德生态环保试验基地的农田中，该农田20年未使用化肥与农药，土壤质量经检测符合《中华人民共和国国家标准土壤环境质量标准——GB15618-1995》所规定的一级土壤标准。试验时选择人工预养1月以上、体重为5 000～15 000 mg、环带明显且大小相近的健康成蚓。

1.1.2  供试土壤  试验基质按照OECD推荐的人工土壤配制方法进行制备。将泥炭藓灰10%、高岭黏土20%（高岭石质量分数大于30%）、石英砂70%（50～200 μm）进行混匀，并使用碳酸钙调节pH至5.5～6.5。取上述样品于105 ℃条件下烘干称重，测定其含水率。以去离子水调节其含水量至35%，并在试验过程中通过称重保持其含水率恒定。

1.1.3  仪器、试剂与耗材  CdCl2·2.5H2O（99%，AR），由上海阿拉丁试剂有限公司提供;浓硝酸、浓盐酸均为GR，由北京化工厂生产;石英砂、高岭土、泥炭土、玻璃管、滤纸（80～85 g/m2，0.2 mm厚，中級），购于北京中创鸿达科技有限公司;酶试剂盒，购于苏州科铭生物技术有限公司。

10～1 000 μL可调式微量加样器（T-300/T-200 -Y/T-1000-B，Eppendorf）;AX2247ZH/E型电子分析天平;人工气候箱（MGC-850HP，上海一恒科学仪器有限公司）、紫外分光光度计（SHP1000525966，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、鼓风干燥箱（WGL-125B，天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2  方法

1.2.1  半致死剂量（LC50）研究  选用OECD标准中的滤纸接触法（Contact filter paper test，OECD-guideline No.207）[5]测定Cd对异毛远盲蚓和赤子爱胜蚓的半致死剂量。具体试验方法如下。

1）蚯蚓清肠。试验前将供试蚯蚓放置于铺有湿润滤纸的培养皿中，并置于温度18 ℃、湿度60%～80%的人工气候箱内孵育24 h，以使蚯蚓排出肠道内容物。

2）胁迫条件设置。①赤子爱胜蚓。根据玻璃管内壁面积将滤纸裁剪为9.5 cm×4.5 cm的滤纸条，并均匀铺置玻璃管中，取以去离子水配制的规定浓度的CdCl2溶液1 mL滴于该滤纸上，使其单位面积中Cd的浓度分别为0、5、10、20、30、40 μg/cm2。②异毛远盲蚓。根据玻璃管内壁面积将滤纸裁剪为8.5 cm×8.5 cm的滤纸条，取以去离子水配制的规定浓度的CdCl2溶液1 mL滴于该滤纸上，使其单位面积中Cd的浓度分别为0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/cm2。

3）半致死剂量测定。含不同浓度CdCl2玻璃管中放入1条蚯蚓为1个处理，10个处理为1个处理组，每个处理组设置3个平行，以不含重金属溶液的处理组为空白对照，避光孵育24和48 h后记录蚯蚓中毒症状和死亡数（以蚯蚓尾部对机械刺激无反应为判定死亡的标准），并计算LC50。

1.2.2  酶类标志物响应规律研究  依据《中华人民共和国国家标准——土壤环境质量标准GB 15618

-1995》对重金属Cd的污染等级划分，设置人工土壤浓度为0、0.2、0.3、0.6、1.0 mg/kg，以模拟赤子爱胜蚓和异毛远盲蚓在低浓度Cd胁迫下的生存环境。将试验所需蚯蚓在无毒基质中预养3 d，期间置于25 ℃人工气候箱中，用称重方法补足蒸发的水分，保持基质的含水量在60%[18]。3 d后，将预养过的蚯蚓手工捡出，转移至新的PVC盒（217 mm×173 mm×98 mm）中，每500 g基质中投放赤子爱胜蚓10条，每10 kg基质中投放异毛远盲蚓20条，每个浓度梯度3个平行，按预先设定的Cd浓度梯度提前1 d准备。试验周期28 d，期间PVC盒置于人工气候箱内，培养条件与预养阶段相同。

1）酶液的制备。于试验的3、7、14、21、28 d进行取样。从每一处理组中随机采集3条蚯蚓，用去离子水洗净体表后，在4 ℃冰箱中低温麻醉10 min，转移至-20 ℃冰箱中冷冻。对冷冻后的蚯蚓解剖分离其表皮/肌肉组织，解剖过程需始终在冰盒中进行。将解剖后的蚯蚓组织称重并置于冰盒上的研钵内，加入适量石英砂，快速研磨，并在此过程中加入预冷的PBS缓冲液5 mL（磷酸二氢钾0.27 g、磷酸二氢钠1.42 g、氯化钠8.00 g、氯化钾0.20 g，调节pH 7.4，定容至1 L），制得的匀浆迅速转移至15 mL离心管中，于4 ℃条件下5 000 r/min离心20 min，分离获得的上清液即为可用于活性测定的酶液。

2）酶活性的测定。①CAT活性的测定。组织中的CAT活性采用紫外分光光度法测定[19，20]。CAT在一定条件下，能分解其底物H2O2，使H2O2在反应液中的吸光度随其浓度的下降而降低，在240 nm处用紫外分光光度计测其吸光度，根据吸光度的变化率可以计算出CAT活性。②T-AOC活性的测定。采用可见分光光度法测定T-AOC活性。在酸性环境下，物质还原Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）产生蓝色的Fe2+-TPTZ的能力反映了其总抗氧化能力。③SOD活性测定。采用可见分光光度法测定SOD活性。黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子（O2-），O2-可还原氮蓝四唑生成蓝色的甲臢，后者在560 nm处有吸收;SOD可清除O2-，从而抑制了甲臢的形成;反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。④GSH-PX活性测定。采用紫外分光光度法测定GSH-PX活性。GSH-PX催化H2O2氧化GSH，产生GSSG;谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+;NADPH在340 nm处有特征吸收峰，而NADP+没有;通过测定340 nm处光吸收减少速率来计算GSH-PX活性。⑤AchE活性测定。采用可见分光光度法测定AchE。AchE催化Ach水解生成乙酰胆碱，乙酰胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）;TNB在412 nm处有吸收峰，通过测定412 mm处吸光度增加速率，计算AchE活性。

1.2.3  数据统计  采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比较法对不同处理间的差异性进行显著性分析（SPSS 23.0）。

2  结果与分析

2.1  半致死剂量

异毛远盲蚓与赤子爱胜蚓在Cd胁迫下，均表现出不同程度的中毒症状，身体变软、充血、环带肿大，有黄色液体渗出;有断裂现象，有的断裂多节，滤纸上有血迹。试验中，空白对照组的蚯蚓没有异常症状和死亡情况。

滤纸接触法的测定结果（图1）表明，随着Cd胁迫浓度的增大，两种蚯蚓的死亡率均呈上升趋势。经统计计算得出，Cd对赤子爱胜蚓24和48 h的LC50分别为21.99和16.95 μg/cm2，Cd对异毛远盲蚓24和48 h的LC50分别为11.23和5.17 μg/cm2，异毛远盲蚓均相对较低，在一定程度上说明了其对Cd的耐受性低于赤子爱胜蚓。

在本试验中，作为阳性对照的赤子爱胜蚓的LC50与Song等[21]、郭永灿等[22]的试验结果有较大差异，这可能是由于供试蚯蚓生长环境的差异造成的。Reinecke等[23]研究发现，长期生活在重金属污染地区的蚯蚓种群普遍对重金属具有更高的耐受性，实验室自行繁育的蚯蚓生长环境较为稳定，不易受到外界条件的影响，这可能导致了其对Cd的耐受性下降。

2.2  酶类标志物响应特征

与无胁迫组（0 mg/kg）相比，共设置了4种胁迫浓度（0.2、0.3、0.6、1.0 mg/kg）和5种胁迫时间（3、7、14、21、28 d），检测了在此条件下异毛远盲蚓和赤子爱胜蚓体内5种酶类标志物（T-AOC、AchE、SOD、CAT、GSH-PX）的响应程度。结果（图2、图3）表明，与对照组相比，异毛远盲蚓体内的5种酶类标志物有68%发生显著变化（相对酶活性>2，即log2FoldChange>1或<-1），其中62%显著上调，6%显著下调;赤子爱胜蚓体内5种酶类标志物60%发生显著变化，其中30%显著上调，30%显著下调。总体来看，与赤子爱胜蚓相比，异毛远盲蚓体内的酶类标志物对低浓度的Cd胁迫具有较高的灵敏度。

具体到每种不同的酶类标志物，通过对其28 d累积相对酶活变化的统计来表征其对Cd胁迫的响应情况。通过假设检验可知，在低浓度Cd胁迫下，异毛远盲蚓和赤子爱胜蚓5种酶类标志物的相对酶活均有极显著的差异（P<0.01）;由图3可以看出，异毛远盲蚓体内的SOD、GSH-PX、CAT、AchE的相对酶活显著高于赤子爱胜蚓，T-AOC相对酶活则明显较低，说明在低浓度Cd胁迫时，SOD、GSH-PX、CAT、AchE这4种酶类标志物更适用于异毛远盲蚓，具有更高的灵敏度。

2.3  酶类标志物的变化规律

由图4可以看出，随着胁迫时间的延长，异毛远盲蚓体内的5种酶类标志物总体上呈现出相对活性先升高后降低的趋势，其响应高峰主要出现在14和21 d时;而赤子爱胜蚓体内的5种酶类标志物变化则并未表现出明显的规律性，其响应高峰多出现在3和7 d时。具体到每种酶类标志物，T-AOC在3～21 d的异毛远盲蚓体内表现出较高的响应强度，在赤子爱胜蚓体内则是3和7 d;AchE和CAT在两种蚯蚓体内均始终保持响应，且在异毛远盲蚓体内响应强度相对较高，AchE更是维持在一个较为稳定的水平;SOD和GSH-PX在3和7 d时在赤子爱胜蚓体内表现出较高的响应强度，但其后急剧降低，而在异毛远盲蚓体内则始终维持较高强度。因此，认为除CAT外，其他4种酶适合作为赤子爱胜蚓在Cd短期（3～7 d）胁迫中的标志物;5种酶均适合异毛远盲蚓在Cd中长期（3～28 d）胁迫时作为标志物。

3  小结与讨论

综合以上分析，本研究可以得到以下结论。

1）异毛远盲蚓对Cd的急性毒性半致死剂量低于赤子爱胜蚓，24和48 h LC50分别为11.23和5.17 μg/cm2，但其对Cd仍具有较高的耐受性。

2）异毛远盲蚓体内的SOD、GSH-PX、CAT、AchE、

T-AOC对低浓度Cd胁迫均具有较高的敏感性，且在28 d试验中始终保持响应状态，适合作为异毛远盲蚓对重金属污染物Cd的生物标志物。

3）SOD、GSH-PX、AchE、T-AOC可以作为赤子爱胜蚓在低浓度Cd胁迫下的短期（3～7 d）的生物标志物。

利用指示生物评价土壤环境质量，最常用的方法是采用标准生物进行毒性试验或繁殖试验，以污染物对生物的存活率和繁殖能力等方面的影响为参考，来评价污染物造成的危害[24-26]。这就要求用于研究的生物具有生态代表性、对污染物的毒害作用敏感且有一定耐受性。环毛蚓属（Pheretima tschiliensis）的蚯蚓在中国南北各地均有分布，且数量较多，属于优势种，具有典型的生态代表性[16]，因此在本研究中重点关注其对污染物的耐受性和敏感性。

半致死剂量是生态毒理学评价的核心指标之一，在一定程度上代表了物种对污染物的耐受性。在本试验中，异毛远盲蚓对Cd的耐受性低于赤子爱胜蚓，但仍远高于《中华人民共和国国家标准-土壤环境质量标准GB 15618-1995》中所规定的土壤Cd含量的最高限制，因此其对Cd具有的耐受性符合作为指示生物的要求。值得注意的是，本研究中出现了作为阳性对照的赤子爱胜蚓（标准种）对Cd的耐受性明顯低于以往的部分研究结果[21，22]的情况，认为生活环境的差异是造成物种间对污染物的耐受性差别的主要原因，有两种可能：一是试验前对蚯蚓进行预养时的环境条件不同，影响了试验结果;二是试验所用的蚯蚓来源有差异，其生存环境的背景值不同，造成了其对某些污染物产生了可遗传的耐受性。这一结果既强调了指示生物的标准化饲养及繁殖流程的重要性，也从侧面揭示了分析野生型蚯蚓的毒理特征对指示生物研究的补充价值。

以污染物的劑量指示生态系统的受损程度是一种直观的表述方法，但受土壤性状（有机质、团粒结构、pH等）的影响，污染物的剂量与毒性间的对应关系是不断变化的，即生物有效性[27，28]。自然土壤中污染物的生物有效性是不断变化的，而生物暴露于污染物后产生的生理、生化方面的反应则是相对稳定的[22]。用蚯蚓的分子、生物化学和生理反应（生物标志物）来检测土壤污染的变化情况已经越来越受到人们的关注[29，30]。更重要的是，与传统的生态毒理研究指标不同，标志物可以在半致死效应变得明显前指示污染物对蚯蚓在个体水平上所产生的影响，也就是说除了对环境污染程度进行评价外，还能对生态系统中蚯蚓群体发生衰减前作出预警。因此，本研究选择了《中华人民共和国国家标准-土壤环境质量标准GB 15618-1995》规定的4种土壤Cd污染的最低限制进行了蚯蚓酶类标志物的试验。结果表明，与对照组相比，处理组异毛远盲蚓体内的5种酶类标志物均发生了显著的变化，这说明选取的酶类标志物对Cd胁迫均具有较高的敏感性，可用作其生物标志物。同时，本研究选取的胁迫浓度较低，在一定程度上模拟了处于污染/未污染边缘的土壤环境状况，与赤子爱胜蚓相比，异毛远盲蚓体内的酶类标志物响应快速（3 d）且持续时间较长（28 d），一定程度上说明了异毛远盲蚓在生态预警作用中的研究潜力较大。

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收稿日期：2019-01-25

作者简介：武静慧（1993-），女（回族），山东济宁人，在读硕士研究生，研究方向为土壤基准，（电话）18810868597（电子信箱）573067334@qq.com;