药用植物microRNA研究现状与展望

严武平 吴友根 于靖 杨东梅 张军锋

（海南大学热带农林学院，海口 571100）

microRNA（miRNA）是一类小的非编码RNA，通常为20-24个核苷酸（Nucleotide，nt），通过序列互补在转录后调控基因表达［1］。microRNA自身不具备开放阅读框架（ORF），不编码蛋白质，具有高度保守性、组织特异性和阶段特异性，通过切割靶mRNA和抑制mRNA翻译，可在动植物中发挥重要的调控作用。1993年，Victor Ambros和他的同事Rosalind Lee及Rhonda Feinbaum发现了一种控制秀丽隐杆线虫幼虫发育时间的基因Lin-4，该基因不编码蛋白而是产生一对小RNAs。一个RNA的长度约为22 nt；另一个约为61 nt；较长的一个被预测会折叠成一个茎环，这个茎环被认为是较短的RNA的前体［2］。Ambros和Ruvkun实验室随后发现这些lin-4 rna与lin-14基因3'UTR的多个位点具有反义互补。这种互补性出现在3'UTR区域，该区域先前被提议用lin-4基因产物介导lin14的抑制［2-3］。Ruvkun 实验室继续证明了这些互补位点对于lin-4调控lin-14的重要性，并表明这种调控在显著降低lin-14蛋白数量的同时，不会显著改变lin-14 mRNA的水平。2000年，Reinhart等［4］发现let-7调控lin-41并非常保守。Let-7的发现，以及当时RNAi领域的兴起，让人们意识到这种调节性小RNA可能是一种广泛存在的基因表达调控机制［4-5］。2001年10月，Thomas Tuschl、David P.Bartel和 Victor Ambros三人分别领导的3个研究组在Science杂志同期发文，将这种小RNA命名为microRNA（微小核糖核酸），简称miRNA。

刚开始miRNA的研究主要集中动物方面，直到2002年才首次在植物中出现报道［6］。植物miRNA几乎调控所有的生物学和代谢过程，包括生长发育、细胞维持和分化、信号转导以及对逆境胁迫的响应。在药用植物中，目前已从一些药用植物中鉴定出miRNA，并分析了其在药用植物中的调控作用，这对药用植物的研究具有重要意义。本文首先对植物miRNA的生物形成途径、作用方式以及植物miRNA及其靶基因的鉴定和验证方法进行了概述，其后概述了miRNA调控药用植物生长发育与药用植物次生代谢产物生物合成，miRNA参与药用植物逆境胁迫等研究现状，并对药用植物与miRNA未来的研究方向进行展望。

1 植物miRNA的生物形成途径

植物miRNA主要是由位于基因间隔区的内源性基因（MIR）编码的，许多miRNA在不同植物物种中是保守的［7］。植物miRNA的生物形成途径如下：首先在细胞核内，大多数植物MIR基因被RNA聚合酶II（Pol II）转录成长度为几百个核苷酸的初级产物pri-miRNA。转录后，pri-miRNA的5'末端加上甲基鸟苷帽子（m7GPPPN）结构，3'末端加上多聚腺苷酸尾（或聚A尾），以稳固pri-miRNA。随 后，pri-miRNAs经 由 DICER-LIKE1（DCL1），HYPONASTIC LEAVES1（HYL1）和SERRATE（SE）为核心组分组成的切割复合物处理，生成成熟的miRNA/miRNA*双链体［8-9］。DCL1主要是以基到环方式分两步处理pri-miRNA。首先切割的是距茎基部15-17 nt或在环形远端茎内的隆起或非结构区域。由此产生的pre-miRNA被DCL1进一步切割生成一个长度为21 nt左右的 miRNA / miRNA *双链［10-11］。miRNA / miRNA *双链两个3'末端的自由羟基被甲基转移酶HUA ENHANCER1（HEN1）甲基化，以羟甲基的形式存在，甲基化的3'末端被保护不受降解［12-13］，稳定后的双链在HASTY（Exportin 5在植物中的同源基因）的作用下从细胞核运送到细胞质［14-15］。miRNA / miRNA *双链进入细胞质后，被装载到ARGONAUTE（AGO）蛋白中，在解旋酶的作用下解离成2条单链，成熟的单链miRNA与AGO蛋白结合（以及一些其他蛋白）形成活性RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）［16］。另一条互补链（miRNA *）除具有的少数功能被保留外其余多数被降解。

2 植物miRNA的作用方式

植物miRNA通过转录切割和翻译抑制两大机制在转录后水平调控靶基因。植物miRNA需要高的互补性来识别其底物［17］。2014年的一项研究表明，在拟南芥中，除了互补，miRNA结合位点的环境和表达水平也可能有助于目标识别［18］。用大规模平行末端分析（Parallel analysis of RNA ends，PARE）对miRNA 介导的降解 mRNA 的剪切片段进行分析发现，大多数植物miRNA目标都经历了转录产物的切割［19］。切割由AGO蛋白的PIWI域完成，该结构域形成RNase H样折叠并显示核酸内切酶活性；这种活性已经在主要miRNA效应物拟南芥 AGO1以及AGO2、AGO4、AGO7和 AGO10中得到证实［20-21］。AGO1切割不需要3'端脱腺苷化或5'端脱帽，就能通过核外酶触发靶mRNA的降解。切割时，5'和3'的切割片段随后被核外酶降解。在拟南芥中，核糖核酸外切酶4（Exoribonuclease，XRN4）是一种5'-3'的核酸外切酶，负责降解3'片段［22］。

miRNA介导的翻译抑制最初是为了解释miRNAs对靶基因抑制的不成比例的影响，即在蛋白质对mRNA水平上［23-24］。后来又对miRNA介导的翻译抑制机制进行了深入研究。2013年的一项研究表明，在植物中，AGO1-miRNA在与目标RNA的5'非翻译区（UTR）或开放阅读框架结合后，能够有效地抑制核糖体的合成或运动［25］。这表明miRNAs可以抑制植物中靶RNA的翻译起始和延伸。有研究表明miRNA介导的翻译抑制与加工体（P-body）之间存在一定的相关性［26］。目前，人们还未能就miRNA介导的mRNA翻译阻遏机制达成共识。在植物中，翻译抑制比转录切割更少被观察到，这可能是由于普遍存在mirna引导的切割，同时由于缺乏高质量抗体，很难确定蛋白质水平。

除了mRNA的切割和翻译抑制外，一些miRNA还会从其靶转录本中触发阶段性次级siRNA（phasiRNA）的产生，这在植物中是一种广泛而保守的现象［16，27］。在拟南芥中有几项研究将miRNA活性位点与多核糖体［28］、内质网膜［29］和膜结合多核糖体［29-30］联系起来。由于AGO1是miRNA的主要效应器，AGO1的亚细胞定位是发现miRNA活性位点的重要线索。

3 植物miRNA及其靶基因的鉴定和验证方法

在植物生长发育过程中miRNA 的表达具有组织特异性和时空特异性。因此，检测和分析不同组织或样品中miRNA及其靶基因的种类与表达特征，可为研究miRNA的生物学功能提供重要信息和依据。传统的miRNA鉴定方法包括直接克隆、正向遗传学和生物信息学预测。从生物样品中分离和克隆小RNA是最直接的方法，目前已发现许多植物miRNA。然而，这种方法并不包括低丰度或在特定环境条件下或在特定组织中表达的miRNA。由于新一代深度测序技术和先进生物信息学的发展，从最开始的直接克隆到生物信息学的介入，保守及新的miRNA的寻找与克隆问题得到了极大的改善［31］。在很多药用植物中（白木香、地黄、卷丹、豆蔻、薄荷、三七、红豆杉、罂粟、人参和半夏等）都实现了深度序列测定（表1）。

植物miRNA与靶mRNA具有高度的序列互补性，通过促进靶mRNA的降解或翻译抑制来负调控基因的表达实现调控功能，其自身不能直接调控植物的生长发育，所以阐明miRNA功能的关键步骤是识别miRNA靶基因。miRNA靶基因的鉴定是miRNA生物学功能研究的关键和难点，目前最常用的研究技术是计算机辅助预测和试验验证。植物miRNA作用的靶基因预测的常用生物信息学资源有BLAST［44］、psRNATarget［45］、miRdeepFinder、C-mii［46］、CleaveLand等。然而，经由生物信息学预测的靶基因存在一定的假阳性，研究人员一般还会采用一些生物学实验来验证miRNA是否可以靶向切割或抑制靶基因的表达［47］。验证靶基因常用的方法主要有5'RLM-RACE［48］、降解组测序［36，38］、qRT-PCR［32］和构建烟草瞬时表达体系等。实验验证方法有多种多样，很多研究人员都会选择联合使用其中2-3种方法进行验证。

表1 药用植物miRNA的鉴定情况

4 miRNA调控药用植物生长发育

迄今为止，miRNA已经被证明可以调节植物和动物的多种生物和代谢过程。在植物中，miRNA控制着各种发育过程，包括叶片形态、花器官发生、腋生分生组织起始等［49］。随着 miRNA 研究的不断深入以及相关技术的不断完善，研究者们已从多种药用植物中鉴定出大量的保守的和新的miRNA，并研究了其在药用植物的生长发育阶段的作用。

植物 miRNA 大多是通过调控编码参与发育调控与细胞分化的转录因子进而调控植物的生长发育过程。Singh等［46］研究表明薄荷科植物精油生物合成的基因调控系统可能受miR156、miR414和miR5021的调控，此外，3种miRNA候选物（miR156、miR5021和miR5015b）也被观察到通过调控MYB、bHLH和WDR 等转录因子参与毛状体发育。Wei等［40］对不同年龄段（一年、两年和三年）的三七根中的miRNA进行差异表达分析，发现miRNA可以靶向与三七根生长发育相关的转录因子，同时还调控皂苷成分的合成。Ding 等［32］采用深度测序从沙棘种子中鉴定出来137个已知miRNA和264个新的miRNA，研究发现miRNA通过靶向转录因子ARF2和调节因子CNR、MED调控种子大小，同时miRNA通过靶向转录因子HLH等调控脂肪酸生物合成。He等［33］通过对卷丹进行高通量测序鉴定出来17个miRNA家族的38个保守miRNA和44个新的miRNA，经由软件和实验预测保守miRNA的靶基因以转录因子为主，新型miRNA的靶基因主要预测为蛋白编码基因。Li等［44］对4年生人参的根、茎、叶和花的转录组进行了全测序，推测人参miR172以转录因子APETALA2（AP2）为靶点，该转录因子在调控开花时间和花形态方面发挥重要作用；MYB转录因子可能是人参中miR5021的靶基因，在发育过程和防御反应中发挥调控作用。Samad等［50］使用计算方法描述了非模型植物小型蓼中新的miRNA的鉴定和特征，推测Pmi-nov_6的靶基因是编码F-box蛋白、组氨酸脱氢酶和WEB蛋白家族的三个mRNA，从而参与调控蛋白质降解、组氨酸的生物和叶绿体运动，进而调控植物发育。

绝大多数miRNA具有高度保守性和组织特异性，也即miRNA在各个物种间具有高度的进化保守性且在同一物种不同组织中表达有不同类型的miRNA。Axtell等［51］发现 miR168 在裸子植物、被子植物和蕨类植物中均可被检测到，而其它 miRNA如 miR165 /166和miR170 /171等也能在多种植物中表达。Xu 等［35］采用芯片微阵列分析技术鉴定半夏中的 miRNA，分析其在半夏叶、茎、块茎 3 个组织器官中的表达发现，叶片中miRNA319的表达水平明显低于茎和块茎，对叶片形态发生可能有一定的促进作用；在块茎中，miRNA319的表达水平是茎和叶中表达水平的近10倍，而miRNA171的表达量明显低于茎和叶，说明miRNA319和miRNA171在块茎中也发挥着重要作用。Wang 等［52］也采用芯片微阵列分析技术从掌叶半夏中鉴定miRNA，研究结果表明所鉴定的miRNA都具有保守性，且经qRTPCR实验显示，所鉴定的miRNA于掌叶半夏的不同组织中的表达量各有不同，根据有关研究推测miR166 调控的靶基因可能叶发育有关，miR156调控的靶基因与花的发育相关，以及miR319、miR167和miR164等调控的靶基因均与掌叶半夏的生长发育相关。

5 miRNA调控药用植物次生代谢产物生物合成

次生代谢产物是由次生代谢产生的一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。次生代谢产物是植物在长期演化过程中与生物和非生物因素相互作用的结果，在植物生长发育和生理学过程中起着重要作用［53］。药用植物发挥药用疗效主要是通过其有效成分，而这些有效成分主要是植物中的次生代谢产物，包括黄酮类、生物碱、糖苷和萜类等。药用植物中有效成分往往具有重要的生理活性，含量却又大多较为低下，严重限制了药物的临床使用，影响药用植物的药用价值。miRNA的生物学功能之一是调控植物次生代谢产物的生物合成。关于药用植物中miRNA的鉴定有很多报道，但迄今为止，只有少数研究报道了通过miRNA调控药用植物次生代谢产物的生物合成。

生物碱是一类通常存在于植物体中（也有少数存于动物体中）的含氮有机化合物，具有抗菌、抗炎、抗癌等功效。罂粟是一种重要的药用植物，可合成苄基异喹啉生物碱（BIAs）作为次生代谢产物。Boke等［42］研 究 发 现，pso-miR13、pso-miR2161、psomiR408等miRNA参与了BIAs的生物合成，预测pso-miR13、pso-miR2161和psomiR408分别靶向编码7-OMT，4-OMT和网状氧化酶样蛋白的基因，这些蛋白都参与生物碱的合成。烟草是研究生物碱生物合成的模式植物。尼古丁是一种烟草特有生物碱，是生物制药、生物农药和生物化工的重要原料。Li等［54］首先研究了miRNA的潜在作用在尼古丁生物合成途径的调控，预测miRX17、miRX27、miRX20和 miRX19分 别 靶 向 QPT1、QPT2、CYP82E4和PMT2基因，这些基因都参与尼古丁生物合成途径。紫杉醇是一种从裸子植物红豆杉的树皮分离提纯的天然次生代谢产物，是一种具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物。Hao等［38］高通量测序和降解组分析鉴定红豆杉miRNA及其靶基因发现，miR164和miR171分别通过靶向调控紫杉烷13α-羟基化酶基因和紫杉烷2α-O-苯甲酰转移酶基因，调控紫杉醇生物合成。

萜类化合物是由甲戊二羟酸衍生、且分子骨架以异戊二烯单元为基本结构单元的化合物及其衍生物，具有祛痰、驱虫、镇痛等功效。青蒿被广泛用于治疗疟疾，青蒿中相对较低的青蒿素（有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色晶状体）含量是其大规模生产的限制因素。为更好地了解青蒿中miRNA对青蒿素合成的影响，Pérez-Quintero等［55］研究预测miR390将靶向参与毛状体发育的基因，毛状体是青蒿素合成的位点，可能成为旨在增加青蒿素含量的遗传转化候选基因。Fan等［37］通过对苍耳腺毛状体和幼叶的miRNA分析，揭示了miRNA在调节萜类生物合成中的作用，推测miR7539、miR5021和miR1134可能通过靶向上游萜类通路基因参与调节萜类生物合成。

6 miRNA与药用植物逆境胁迫

植物在不同的逆境胁迫下诱导特异 miRNA的表达，并证实了某些 miRNA在植物遭受逆境胁迫时而做出适应性调整的过程中起着重要的调控作用［56］。许多研究表明，miRNA参与多种非生物胁迫和生物 胁 迫。 例 如，miR398，OsmiR399、miR395等miRNA参与植物对营养胁迫的应答过程［57］。我国药用植物资源丰富，但随着研究的不断深入，其需求也在不断增加。野生药用植物产量普遍较低，易受外界环境的影响。因此，研究药用植物中参与逆境胁迫相关的miRNA也具有重要的意义。到目前为止，研究者们已经使用了不同的生物技术和鉴定方法来研究参与药用植物逆境胁迫的miRNA，并取得了一些进展。

Nadiya等［34］通过深度测序鉴定了可能参与豆蔻野生基因型防御应答、胁迫和植物生长特性的miRNA，差异表达分析显示，鉴定出的miRNA大部分在栽培品种中高表达，而miR169在野生豆蔻中的低表达和miR529的高表达证明了野生基因型比栽培品种具有更强的抗旱性和花发育能力。Wang等［52］对掌叶半夏中的miRNA研究发现，miR397在叶片组织中的表达水平几乎是茎部的8倍，其作用的靶基因与氧化胁迫、干旱胁迫、冷胁迫、营养胁迫、铜胁迫等各种胁迫响应有关。Wu 等［58］对5年生人参的叶、茎、花和根进行高通量测序，鉴定出了33个miRNA家族的73个保守miRNA和9个miRNA家族的28个非保守miRNA，并对其中一些miRNA进行了预测与实验验证，分析发现非保守miRNA中 miR6138、miR6135e、miR6135i、miR6140a、miR6143-3p与高温胁迫有关，而miR6136b、miR6135k、miR6139、miR6140d、miR6140则 与 高温胁迫和干旱胁迫都有关。此后另一研究小组［44］对4年生人参的根、茎、叶和花的转录组进行了测序分析发现，在新确认的14条miRNA中miR1128、miR5658、miR5021 靶向锌指蛋白，参与氧化胁迫和其他非生物胁迫应答。

7 总结与展望

中国是药用植物资源最丰富的国家之一，对药用植物的发现、使用和栽培有着悠久的历史。然而随着需求量的增加，野生药用资源已远远不足以提供所需，且野生资源易受环境的影响。miRNA是一种重要的调控因子，植物miRNA几乎调控所有的生物学和代谢过程，包括生长发育、细胞维持和分化、信号转导以及对逆境胁迫的响应。近年来，植物miRNA的研究报告呈爆炸式增长，大批量的miRNA已从药用植物中被鉴定出来。预测了大量miRNA靶基因，其中一些靶基因得到了实验验证。这些初步工作将为今后该领域的研究奠定基础。目前大多数miRNA的功能尚不清楚，在miRNA的鉴定和功能的确认之间存在很大的差距。对miRNA介导基因调控的研究可能会为改善药用植物的性状提供新的策略，如提高药用植物产量、质量或抵抗各种环境胁迫。随着新的植物育种技术的发展，加上对整个基因组的结构和功能的更深层次的研究，将促进未来培育药用植物新的重要性状的技术进一步发展。

药用植物可产生次生代谢产物，用于植物医学。然而这些次生代谢产物在药用植物中产出量极低，且次生代谢物质的产生是发育程度、组织分化及外界刺激因素通过影响生物合成基因表达而控制［59］。因此，研究人员寻找一种方法来增加药用植物中次生代谢产物的含量成为当务之急。到目前为止，已有少数研究报道了通过miRNA调控药用植物次生代谢产物生物合成［60］。对于许多药用植物来说，获得足够的次生代谢物产量通常是一项困难的任务。因此，我们需要一个有效的程序来操纵药用植物，以改变次生代谢产物水平。从这个意义上说，已经有文献证实miRNA在药用植物次生代谢物的产生中起关键作用［61］。尽管有许多关于鉴定可能的miRNA作为各种药用植物次生代谢物生物合成途径中涉及的调节因子的研究，我们仍需要更深入地了解它们在植物次生代谢物生产中的调节作用。