抗环瓜氨酸化抗体分离及其对巨噬细胞功能影响

任丹丹，朱晓冬，邱 收，于 鑫，朱 伟

(牡丹江医学院免疫教研室，黑龙江牡丹江157011)

类风湿性关节炎(rheumatiod arthritis,RA)是致残率较高且常见的自身免疫性疾病。RA患者血液及关节液中常可检测到自身抗体(类风湿因子 RF)，自身抗体检测已成为临床辅助诊断RA的指标之一。近年来，随着瓜氨酸化的纤连蛋白、波形蛋白和胶原蛋白被确认为RA中的自身抗原后[1]，抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPAs)检测明显提高了诊断特异性，特别是第二代ACPAs即抗环瓜氨酸化抗体(CCP抗体)的出现，使诊断的灵敏度及特异性分别提高到60%～80% 和95%～98%，逐渐取代RF成为临床辅助诊断RA的检测指标之一[2]。ACPAs与RA病情严重程度、药物治疗效果密切相关，但ACPAs促进RA病情发展的机制仍处于研究中。关节滑膜增生、血管翳形成及巨噬细胞大量浸润是RA特征性病例变化。巨噬细胞数量变化与RA病情发生、发展密切相关[3]。

为此本研究中，笔者从RA患者血清中分离ACPAs，观察ACPAs对巨噬细胞功能的影响，探讨ACPAs促进病情发展的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

THP-1细胞，中国科学院上海细胞所；CCP多肽，由上海强耀公司合成；活化HP柱，GE公司；RNA提取试剂盒，Omega公司；逆转录试剂盒及SYBR，罗氏公司；蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)抗体，Abcam公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜，Millipore公司；佛波酯(PMA)、人免疫球蛋白(Ig)G，Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 ACPAs分离纯化

根据GE HP柱说明书，将环瓜氨酸肽(CCP)多肽与活化HP柱结合，制成亲和层析柱。收集CCP 大于200 000 IU/L的RA患者血清，将RA患者血清与CCP亲和层析柱4 ℃孵育过夜。用0.02 mol/L、pH 7.0磷酸盐缓冲液洗去未吸附成分，用0.05 mol/L、pH 3.0甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，与CCP结合ACPAs，将洗脱液迅速用1.0 mol/L、pH 8.0三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液中和后，利用截留分子量为30 000 MWCO超滤离心管浓缩收集含有ACPAs洗脱液。CCP 酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测证实分离ACPAs可与CCP结合。

1.2.2 细胞培养及处理

THP-1细胞培养于含有100 000 U/L青霉素、100 g/L链霉素及10%胎牛血清RPMI-1640培养液中。将THP-1细胞与佛波酯(PMA)50 μg/L共同培养24 h后可将THP-1细胞诱导为巨噬细胞。将PMA诱导巨噬细胞分别与IgG(10 mg/L)及不同浓度ACPAs共同培养24 h或48 h，收集细胞备用。利用Lip2000将siRNA-AKT、siRNA-NC转染PMA诱导巨噬细胞，将转染细胞分别与IgG(10 mg/L)，ACPAs(40 000 IU/L)共同培养24或48 h，收集细胞备用。

1.2.3 逆转录及荧光定量PCR

将ACPAs处理转染siR-AKT、siR-NC及非转染THP-1细胞,RNA提取利用试剂盒，按照说明书操作进行。将1 μg总RNA利用RT盒合成cDNA第一条链，利用SYBR通过以下引物序列进行扩增人TNF-α,F 5′-T￣G￣G￣C￣G￣T￣G￣G￣A￣G￣C￣T￣G￣A￣G￣A￣G￣A￣T￣A-3′,R 5′-C￣T￣G￣G￣T￣A￣G￣G￣A￣G￣A￣C￣G￣G￣C￣G￣A￣T￣G-3′; 人IL-6 F 5′-T￣T￣C￣G￣G￣T￣C￣C￣A￣G￣T￣T￣G￣C￣C￣T￣T￣C￣T-3′,R 5′-G￣G￣T￣G￣A￣G￣T￣G￣G￣C￣T￣G￣T￣C￣T￣G￣T￣G￣T￣G-3′; 人iNOSF 5′-G￣A￣G￣C￣C￣A￣G￣G￣C￣C￣A￣C￣C￣T￣C￣T￣A￣T￣G￣T-3′,R 5′-G￣T￣C￣C￣T￣C￣G￣A￣C￣C￣T￣G￣C￣T￣C￣C￣T￣C￣A￣T-3′。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，mRNA相对表达量通过2-ΔΔCt方法计算。

1.2.4 蛋白印迹(Western blotting)检测

将ACPAs处理转染siR-AKT、siR-NC及非转染THP-1细胞利用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取30 μg蛋白上样，蛋白质经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿转到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，4 ℃一抗室孵育过夜(AKT、p-AKT和GAPDH)，二抗室温孵育1.5 h，GE AI600多功能成像仪显影，GADPH作为内参，目的蛋白与GAPDH条带灰度值比值作为目的蛋白相对含量，p-AKT蛋白含量与AKT蛋白含量相比较。

1.2.5 流式细胞检测

将ACPAs处理巨噬细胞经磷酸盐缓冲液1 000 r/min离心5 min后，将细胞与Percp-cy5.5标记抗CD68抗体，APC标记抗HLA-DR抗体4 ℃孵育30 min，利用BD Accuri C6流式细胞仪检测CD68+HLA-DR+细胞。

1.3 统计学方法

实验数据用均数±标准差(x±s)表示，利用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACPAs分离纯化

利用CCP ELISA检测试剂盒发现：利用活化HP柱制备CCP亲和层析柱可很好地从RA患者血清中分离ACPAs，可用于后续细胞学实验。

2.2 ACPAs对巨噬细胞炎性细胞因子的影响

将PMA诱导巨噬细胞与IgG 10 mg/L(对照)及不同浓度ACPAs共同培养24 h，提取RNA，荧光定量PCR检测，结果见图1。由图1可知：与对照IgG组相比，ACPAs 40 000 IU/L可明显促进TNFα、IL-6和iNOS mRNA的表达，是对照组表达量的1.92、2.21和1.98倍。

图1 ACPAs对PMA诱导的THP-1细胞炎性因子表达的影响Fig.1 Effects of ACPAs on PMA-induced proinflammtorycytokines expression in THP-1 cell

2.3 ACPAs对巨噬细胞表面HLA-DR表达的影响

将PMA诱导巨噬细胞与IgG 10 mg/L及不同浓度ACPAs共同培养48 h，收集细胞，与荧光抗体孵育后利用流式细胞仪检测，结果见图2。

由图2可知：与对照IgG组相比，ACPAs 40 000 IU/L可明显促进细胞膜表面HLA-DR分子的表达，表达量是对照组表达量的2.58倍。

图2 ACPAs对PMA诱导的THP-1细胞HLA-DR分子表达的影响Fig.2 Effects of ACPAs on PMA-induced HLA-DR expression in THP-1 cell

2.4 ACPAs对巨噬细胞p-AKT蛋白表达的影响

将PMA诱导巨噬细胞与IgG 10 mg/L(对照)及不同浓度ACPAs共同培养48 h后，收集细胞提蛋白，利用Western blotting检测，结果见图3。

由图3可知：与对照IgG组相比，ACPAs 40 000 IU/L可明显促进细胞p-AKT蛋白表达，表达量是对照组表达量的2.78倍(P<0.01)。

与IgG组相比，**表示 P < 0.01,n=3图3 ACPAs用量对PMA诱导的THP-1细胞p-AKT蛋白表达的影响Fig.3 Effects of ACPAs on PMA-induced p-AKTprotein expression in THP-1 cell

2.5 SiR-AKT对ACPAs诱导巨噬细胞炎性因子表达的影响

将siR-AKT、siR-NC转染PMA诱导THP-1细胞，将转染细胞与ACPAs 40 000 IU/L共同培养48 h，收集细胞提蛋白，利用Western blotting和荧光PCR检测分析，结果见图4～5。

由图4～5可知：与单独ACPAs作用组相比，siR-AKT转染可使AKT表达量下降50%(图4，P<0.05)，证实转染成功。同时荧光定量PCR检测发现：siR-AKT可抑制ACPAs诱导的炎性因子表达，与对照组(ACPAs组)相比，siR-AKT可使ACPAs诱导的TNFα、IL-6和iNOS mRNA表达量下降(图5，P<0.05)。

与IgG组相比，*表示P<0.05,n=3图4 SiR-AKT对ACPAs诱导AKT蛋白表达影响Fig.4 Effects of siR-AKT on ACPAs-induced AKTprotein expression

与ACPAs组相比，*表示P<0.05,n=3图5 SiR-AKT对ACPAs诱导炎性因子表达影响Fig.5 Effects of siR-AKT on ACPAs-induced AKTprotein expression

2.6 讨论

类风湿性关节炎是以关节组织慢性炎症为主要表现的系统性自身免疫性疾病。病变主要表现为关节炎症细胞浸润，骨、软骨损伤及关节畸形、强直，具有较高的致残率和死亡率。该病不仅严重影响患者生活质量，还带来沉重的社会及经济负担。RA的发病机制仍处于研究阶段，现已发现活性异常增高的T、B淋巴细胞与滑膜处大量浸润巨噬细胞之间复杂的相互作用，促进了疾病的发生、发展[3-4]。关节滑膜增生、血管翳形成是RA特征性病理变化，增生滑膜及血管翳中大量浸润的巨噬细胞及其分泌TNFα、IL-6、IL-1和MMPs是介导RA炎症及软骨损伤的主要因素之一[5]。巨噬细胞功能具有极强可塑性，不同刺激因素可诱导巨噬细胞分化成功能不同的两个亚群： M1和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞高表达MHCⅡ类分子，分泌TNFα、IL-23和IL-6等炎性细胞因子，具有促炎作用；而M2型巨噬细胞高表达Arg-1，分泌IL-10、TGFβ等抑炎因子，具有抑炎反应的作用。且随外界环境刺激因素变化，诱导分化的M1和M2型巨噬细胞之间可以相互转换[6]。

ACPAs是临床诊断RA常用的辅助诊断指标，ACPAs与RA病情发生、发展密切相关，且流行病学调查显示：ACPAS阳性的RA患者都伴有较差的预后。ACPAs可通过与细胞膜表面GRP78蛋白结合，活化ERK1/2、 JNK 通路促进巨噬细胞分泌TNFα[7-8]。也可通过与细胞膜表面Fc受体结合促进细胞合成TNFα[9-10]。

3 结论

研究发现ACPAs可促进M1型巨噬细胞特征性因子TNFα、IL-6、iNOS和HLA-DR表达增高，说明ACPAs可促进巨噬细胞向M1型转化。通过转染siR-AKT进一步证明ACPAs可通过活化AKT-P，促进巨噬细胞向M1型转化、分泌各种炎性因子，加重炎症反应。