素馨护肝方对ANIT诱导大鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用

曾惠芬 戴卫波 欧焕娇

【摘要】 目的：觀察中药复方素馨护肝方对胆汁淤积型大鼠T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA含量的影响，探讨该复方防治肝内胆汁瘀积的作用机制。方法：SD雄性大鼠40只，体重（200±10）g，根据体重随机分为4组，即正常对照组、模型组、阳性药熊去氧胆酸组、素馨护肝方组，每组10只，分笼饲养于屏障级动物环境，自由饮水。给药组给予相应的药物，模型组和正常对照组给予生理盐水，连续灌胃4 d。实验第5天，除正常对照组外，其他各组一次性灌胃ANIT橄榄油，灌胃前12 h禁食不禁水，正常对照组灌胃等体积的橄榄油。造模4 h后各组给予相应的药物或生理盐水。造模后给予相应药或水连续3 d，最后一次药后1 h麻醉取样后处死动物，各动物处死前禁食不禁水12 h。空腹取血，收集肝脏标本。全自动生化分析仪检测血清中T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA的含量。结果：与模型组比较，素馨护肝方组血清T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA均显著降低（P<0.01）。HE染色显示，素馨护肝方组减少炎性细胞浸润范围和纤维细胞增生程度。结论：素馨护肝方能明显抑制肝内胆汁瘀积大鼠血清T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA水平，从而减轻肝细胞的损伤，这可能是其防治肝内胆汁瘀积的重要机制之一。

【关键词】 胆汁瘀积; 素馨护肝方; 血清胆红素; 胆汁酸

【Abstract】 Objective：To observe the effects of Chinese herbal compound Suxin Hugan recipe on the levels of T-BIL，D-BIL，I-BIL and TBA in cholestasis rats，and to explore the role mechanism of compound recipe in preventing and treating intrahepatic cholestasis.Method：40 SD male rats weighing（200±10）g were randomly divided into 4 groups according to body weight，including normal control group，model group，positive ursodeoxycholic acid group and Suxin Hugan recipe group，10 rats in each group.They were fed in separate cages in barrier-level animal environment and were free to drink.Drug administration groups were given the corresponding drugs，and model group and normal control group were given normal saline，and they were continuously given intragastrical administration for 4 d.On the 5th day of the experiment，the other groups were intragastrically administered with ANIT olive oil except for normal control group，and they were fasted for 12 h and free to water before the intragastrical administration，and normal control group was given an equal volume of olive oil.After 4 h of modeling，each group was given the corresponding drug or normal saline.After modeling，they were given corresponding drug or water continuously for 3 d，and the animals were sacrificed at 1 h after the last administration，and the animals were fasted for 12 h and free to water before being sacrificed.Blood was taken on an empty stomach and liver specimens were collected.The levels of T-BIL，D-BIL，I-BIL and TBA in serum were detected by automatic biochemical analyzer.Result：Compared with model group，Suxin Hugan recipe group significantly reduced the levels of serum T-BIL，D-BIL，I-BIL and TBA（P<0.01）.HE staining showed that Suxin Hugan recipe group reduced the extent of inflammatory cell infiltration and the degree of fibroblast proliferation.Conclusion：Suxin Hugan recipe can significantly inhibit the levels of serum T-BIL，D-BIL，I-BIL and TBA in rats with intrahepatic cholestasis，thus reducing the damage of hepatocytes，which may be the one of important role mechanisms of prevention and treatment of intrahepatic cholestasis.

【Key words】 Cholestasis; Suxin Hugan recipe; Serum bilirubin; Bile acidFirst-authors address：Xiaolan Hospital Affiliated to Southern Medical University，Zhongshan 528415，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.15.006

肝内胆汁淤积（intrahepatic cholestasis，IC）属黄疸病范畴，是指胆汁的生成和/或胆汁内容质排出障碍，如体内胆汁中的胆酸、胆红素、胆固醇等物质排出进入血液，并不断堆积，导致肝细胞损伤[1]。肝内胆汁淤积后高胆红素血症和高胆汁酸血症可导致肝脏细胞损伤或凋亡，诱发肝纤维化或肝硬化[2]。素馨护肝方是本院应用十余年的临床协定验方，具有清热祛湿、利胆退黄、舒肝止痛的功效，在急慢性肝炎、胆囊炎、脂肪肝等病症的治疗上千例，有较好的临床疗效。本研究拟通过肝内胆汁淤积型大鼠模型观察血清总胆红素（T-BIL）、直接胆红素（D-BIL）、间接胆红素（I-BIL）、总胆汁酸（TBA）含量，以及肝组织病理变化，探讨本方治疗肝内胆汁淤症的作用机制、临床疗效与安全性，为进一步开发和临床应用本方提供可靠的依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试药 素馨护肝方（由素馨花、茵陈、白芍、夏枯草、车前草等组成）由南方医科大学附属小榄医院中药房提供。熊去氧胆酸胶囊（生产厂家：Losan Pharma GmbH，批号15A10039L，规格：250 mg），1%α-萘异硫氰酸酯（ANIT，生产厂家：河北北化恒业精细化学品），橄榄油（生产厂家：国药集团化学试剂有限公司，批号F20100512，），水合氯醛（生产厂家：天津市福晨化学试剂厂，批号20090207），甲醛溶液（生产厂家：广东汕头市西陇化工股份有限公司，批号1506182）。血清中T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA由广东省医学实验动物中心生化分析仪检测。

1.1.2 仪器 数码显微镜（型号：BK-DM500型数码生物显微镜，生产厂家：重庆奥体光学显微镜有限公司）、切片机（型号：LEICA2015-RM型切片机，生产厂家：德国徕卡有限公司）。

1.1.3 动物 雄性SD大鼠，200 g左右，购于广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2013-0034。

1.2 方法

1.2.1 藥物的制备

1.2.1.1 素馨护肝方煎剂制备 按组方比例称取各药材292 g，水煎煮2次，大鼠临床等效剂量为12.42 g/kg，配成生药浓度0.621 g/mL，大鼠按体重给药体积2 mL/100 g进行给药。

1.2.1.2 阳性药制备 取熊去氧胆酸胶囊粉末用生理盐水溶解，按给药剂量100 mg/kg，给药体积2 mL/100 g大鼠体重，配制成药物浓度5 mg/mL进行给药。

1.2.1.3 造模剂制备 1% ANIT橄榄油溶液，称取1.2 g ANIT溶于120 mL橄榄油中。

1.2.2 分组与给药 SD雄性大鼠40只，体重（200±10）g，根据体重随机分为4组，即正常对照组、模型组、阳性药熊去氧胆酸组、素馨护肝方组，每组10只，分笼饲养于屏障级动物环境，自由饮水。阳性药熊去氧胆酸组和素馨护肝方组给予相应的药物，模型组和正常对照组给予生理盐水，连续灌胃4 d。

1.2.3 造模方法 实验第5天，除正常对照组外，其他各组一次性灌胃ANIT橄榄油，灌胃前12 h禁食不禁水，正常对照组灌胃等体积的橄榄油[3]。造模4 h后各组给予相应的药物或生理盐水。造模后给予相应药物或生理盐水连续3 d，最后一次给药后1 h麻醉取样后处死动物，各动物处死前禁食不禁水12 h。

1.2.4 样品采集与检测

1.2.4.1 血清检测 末次给药1 h后，水合氯醛麻醉，腹主动脉采血两管，3 500 r/min离心5 min，分离血清，全自动生化分析仪检测血清中T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA的含量。

1.2.4.2 肝组织病理学检测 切取肝右叶组织10%甲醛固定，包埋切片，HE染色，观察肝细胞情况、纤维化程度、炎性细胞浸润情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，配对设计资料采用配对t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对血清胆红素和胆汁酸含量的影响 模型组大鼠血清T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA值均显著高于正常对照组，差异均有统计学意义（t=10.331、11.125、10.265、17.175，P=0.001、0.001、0.001、0.001）;与模型组比较，素馨护肝方组和熊去氧胆酸组药后对血清T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA均有显著降低作用，差异均有统计学意义（素馨护肝方组：t=8.465、7.126、9.351、9.784，P=0.001、0.001、0.001、0.001;熊去氧胆酸组t=9.745、8.987、8.362、8.792，P=0.001、0.001、0.001、0.001）。见表1。

2.2 肝组织病理学检测 HE染色显示，正常对照组肝细胞排列整齐，未见细胞肿胀、坏死及炎性细胞浸润，细胞结构清晰;ANIT诱发的胆汁淤积性模型大鼠肝组织细胞可见明显坏死，胆小管上皮细胞肿胀明显，可见成纤维细胞和炎性细胞浸润，坏死区域发生纤维化改变;素馨护肝方组和熊去氧胆酸组均可明显减轻肝细胞损伤程度，减少炎性细胞浸润范围和纤维细胞增生程度。见图1。

3 讨论

肝内胆汁淤积（intrahepatic cholestasis，IC）又称之为胆汁淤积综合征，指肝细胞分泌排泄胆汁障碍，引起肝内胆汁淤积和血液中胆汁成分增加，但患者胆道并无明显堵塞，在脂肪性和酒精性肝病，病毒性肝炎，药物性肝损害等肝病均可诱发，是加速发展为肝硬化的重要因素之一。类似于中医“黄疸”，肝胆疏泄失常，胆汁外溢[4]，表现为血清ALT、AST、ALP、γ-GGT等转氨酶及T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA等血清中胆红素、胆汁酸水平升高。肝内胆汁淤积症在中医系统应属“黄疸”病之范畴，中医观点认为胆汁淤积的主要病变特点就是胆汁排泄不畅，通过调整肝胆脾胃气机，疏降胆气，祛除郁积之邪气，使胆汁排泄有道，胆气条达疏泄，气机升降恢复至正常。

本研究所用素馨护肝方由素馨花、茵陈、白芍、夏枯草、车前草等10味药物组成，全方作为本院临床验方，具有清热祛湿、利胆退黄、舒肝止痛的功效，正符合肝内胆汁淤积症“利湿退黄”的治疗机制[5-10]。

淤胆型肝炎实验室检查的主要指标是肝功能，其中包括血清胆红素、胆汁酸。胆红素主要来源于体内衰老的红细胞，红细胞分解释放出血红蛋白，在肝、脾及骨髓的单核一吞唾细胞系统中被分解和破坏而生成胆红素。非结合胆红素增高是由生产过多、摄取障碍或结合胆红素生成异常所致。淤胆型肝炎主要以直接胆红素升高为主[11-15]。ANIT既损伤肝细胞，又损伤胆管细胞，引起血液中胆红素和转氨酶急剧升高，胆汁流量减少，炎性细胞增加以及肝细胞坏死，相似于人类肝内胆汁淤积的病理改变，可作为退黄药物研究模型[16-20]。

本研究拟通过对肝内胆汁淤积型大鼠急性肝内胆汁淤积进行干预，研究結果显示素馨护肝方能明显缓解肝内胆汁淤积大鼠的肝细胞损伤，降低其血清中T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA水平含量。提示素馨护肝方对ANIT诱发的大鼠急性肝内胆汁淤积所造成的急性肝损伤有明确的保护作用。

参考文献

[1] Kosters A，Karpen S J.The role of inflammation in cholestasis clinical and basic aspects[J].Semin Liver Dis，2010，30（2）：186-194.

[2]肖莉，叶放.论清化湿热瘀毒法是基于张仲景黄疸理论的重要治法[J].中华中医药学刊，2011，30（4）：733-734.

[3]陆云飞，刘成，陈晓蓉，等.消黄方对α-萘异硫氰酸酯大鼠黄疸模型肝组织氧化应激的影响[J].中华中医药杂志，2012，27（2）：460-462.

[4]阳丽梅，黄旭慧，曹娃，等.苦参碱对α-萘异硫氰酸酯诱导的大鼠胆汁淤积性肝损伤的作用[J].中国药学杂志，2018，53（10）：783-787.

[5]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编（下册）[M].2版.北京：人民卫生出版社，2000.

[6]江苏新医学院.中药大辞典（上册）[M].上海：上海科学技术出版社，1977.

[7]谭梅傲，康锦花，佘世锋，等.茵栀黄注射液对胆汁淤积性肝炎大鼠氧化应激反应及FXR基因表达的影响[J].广州中医药大学学报，2018，35（3）：466-470.

[8]张广玉，张玉峰，汪伟，等.利胆退黄汤对ANIT诱导的胆汁淤积型黄疸模型大鼠的治疗作用[J].新中医，2018，50（6）：1-5.

[9]龙安予，郑俊霞，刘蕊.垂盆草苷对实验性幼年大鼠肝内胆汁淤积的干预作用[J].辽宁医学杂志，2018，53（2）：23-25.

[10]王菊平，李小芹，李永春.五味子甲素对急性肝内胆汁淤积大鼠肝功能的保护作用研究[J].亚太传统医药，2018，14（6）：32-33.

[11]李晓玲，孙凤霞，王晓静，等.复方茵丹汤对大鼠急性肝内胆汁淤积的干预作用[J].中国中西医结合消化杂志，2014，22（9）：497-500.

[12]杨擎，曲晓波，李辉，等.五味子化学成分与药理作用研究进展[J].吉林中医药，2015，35（6）：626-628.

[13]温延丽，张振武，张兴威.中西医结合治疗妊娠肝内胆汁淤积症临床分析[J].亚太传统医药，2014，10（13）：87-88.

[14]欧巧群，钱新华，黄笑群，等.ANIT诱导大鼠亚急性肝内胆汁淤积的生化和病理变化[J].胃肠病学和肝病学杂志，2015，24（4）：463-465.

[15]谢敬东，赵钢德，谢青，等.丁二磺酸腺苷蛋氨酸治疗胆汁淤积性肝炎的临床疗效[J].肝脏，2013，18（8）：550-552.

[16]高宇，柴进，李绍雪，等.川西獐牙菜醇提物对内毒素所致大鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用[J].第三军医大学学报，2014，36（8）：769-773.

[17]韩平，田德安.肝内胆汁淤积发病机制及药物治疗新进展[J].胃肠病学和肝病学杂志，2016，25（5）：584-588.

[18] Cullen J M，Faiola B，Melich D H，et al.Acute alpha-naphth-ylisothiocyanate-induced liver toxicity in germfree and conventional male rats[J].Toxicologic Pathology，2016，44（7）：987-997.

[19] Golbar H M，Izawa T，Bondoc A，et al.Attenuation of alphanaphthylisothiocyanate（ANIT）-induced biliary fibrosis bydepletion of hepatic macrophages in rats[J]Exp Toxicol Pathol，2017，69（4）：221-230.

[20] Watashi K，Urban S，Li W，et al.NTCP and beyond：opening the door to unveil hepatitis B virus entry[J].International Journal of Molecular Sciences，2014，15（2）：2892-2905.

（收稿日期：2019-01-23） （本文编辑：程旭然）