抑制PI3K/AKt信号通路对帕金森病相关基因Nurr1表达的影响

庞霖霖 欧阳强 韦宁 钟才 刘亚媛 周少旦 吕庚珉 何荣新 闫灵婉

(广西壮族自治区民族医院 广西医科大学附属民族医院神经内科，广西 南宁 530001)

帕金森病(PD)是除阿尔茨海默病外的第二大中枢神经系统退行性疾病，发病呈年轻化趋势〔1〕。目前，PD仍无明确的发病机制，研究显示小胶质细胞参与的神经炎症贯穿PD的发病及其进程中〔2〕，小胶质细胞作为中枢神经系统内固有的神经免疫细胞，根据功能状态的不同可以分为经典激活M1型和选择激活M2型〔3〕，M1型主要促进炎症因子和氧化应激分子的释放，造成组织损伤；M2型主要具有抑制炎症、促进组织修复及发挥神经保护作用。在大脑损伤、病理状态或其他刺激下，小胶质细胞大量激活通过释放肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、干扰素(IFN)-γ等，这些因子又可以造成多巴胺能神经元的死亡〔4〕。中脑黑质是小胶质细胞较为密集的区域，对神经炎症的过程比较敏感。孤核受体家族成员Nurr1基因不仅可以在体内外发挥抑炎作用，而且对多巴胺酪氨酸羟化酶(TH)形成及多巴胺能神经元的表型分化也发挥关键作用〔5〕。

近年研究发现，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKt)信号通路与PD联系较紧密，牡荆素可以激活PI3K/AKt信号通路对PD模型的多巴胺能神经元发挥保护作用〔6〕；PI3K/AKt信号与PD的炎症机制存在密切关联，Shh信号通路激活抑制小胶质细胞介导的中枢神经系统炎症与PI3K/AKt信号通路的激活有关〔7〕，目前尚无单独研究PI3K/AKt信号通路与PD相关基因Nurr1的关系。本实验拟分析抑制PI3K/AKt信号通路对Nurr1及抗炎因子表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂 BV2细胞株(广州吉妮欧生物科技有限公司)；胎牛血清(FBS)、DMEM 高糖培养基、含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶、青链霉素、磷酸盐缓冲液(PBS)等(GIBCO公司，美国)；脂多糖(LPS，Sigma公司，美国)；LY294002(LY，Santa Cruz公司，美国)；电化学发光(ECL)液(赛默飞公司，美国)；Trizol试剂 (invitrogen 公司，美国)；荧光定量(Q)-PCR试剂盒、逆转录试剂盒、RNase-free H2O(TakaRa公司，大连)；CCK-8试剂(碧云天，中国)β-acting、辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗兔(中杉金桥生物技术有限公司，中国)；引物由invitrogen 公司合成。引物序列为β-actin正义：5′-GTTACAGGAAGTCCCTCACCC-3′，反义：5′-CAGAAGCAATGCTGTCACCTT-3′；Nurr1正义：5′-AAGACCTTCTCCCAAGCACG-3′，反义：5′-GAACTGGACACTTCAACCAGC-3′；IL-4正义：5′-TCACTGACGGCACAGAGCTA-3′，反义：5′-TGTCGCATCCGTGGATATGG-3′；TGF-β1正义：5′-GGTCCTTGCCCTCTACAACC-3′，反义：5′-CCACGTAGTAGACGATGGGC-3′。

1.2 细胞培养 BV2小胶质瘤细胞系在高糖型DMEM 培养基(含10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 pg/ml链霉素)中培养。培养箱环境为95%空气、5%CO2、37℃。

1.3 细胞处理及分组 BV2细胞悬液以1×105/ml的密度接种于6孔板中，置于培养箱中培养，第2天换液的同时处理细胞，细胞分为5组，对照组：正常培养基；LPS组：1 μg/ml LPS添加到培养基中培养；LY+LPS组：20 μmol/L LY先处理0.5 h，再用1 μg/ml LPS添加到培养基中培养；LY组：20 μmol/L LY处理。收集各组细胞上清液。

PC12细胞以1×105/ml的密度接种到96孔板中，培养箱中培养过夜后换液并处理细胞，各处理组加入BV2细胞处理后上清液，对照组加入不含细胞的培养液，每组分别设3个复孔，24 h后CCK-8检测其存活率。

1.4 Western印迹检测p-AKt蛋白含量 按上述方法培养和处理细胞后提取细胞总蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法检测蛋白浓度，调平各组细胞浓度，各组取40 μg蛋白样品于聚丙烯酰胺凝胶电泳，275 mA 电流2 h将蛋白转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用封闭液(50 g/L BSA、0.1% Tween-20 TBS)封闭后，加p-AKt抗体(1∶1 000)、AKt抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜。次日，二抗于室温孵育2 h，化学发光显影。

1.5 Q-PCR检测IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA表达量 按上述方法培养和处理细胞后用Trizol 法提取各组细胞总RNA。在NanoDrop-1000分光光度计上检测RNA水平，按RT-PCR 反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。采用SYBR荧光染料法，反应体系为SYBR 10 μl、ROX 0.4 μl、 cDNA 2 μl、上下游引物各0.8 μl、ddH2O 6.0 μl；ABI 7500软件检测分析，扩增条件：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，每个样本设3 个复孔。

1.6 CCK-8检测PC12细胞的存活率 按上述PC12细胞培养和处理后，去掉旧的培养基，每孔加入新的200 μl培养液和20 μl CCK-8工作液，避免气泡产生；将96孔板放入培养箱培养1 h后，酶标仪上450 nm波长检测每组的光密度(OD)值。存活率=(用药组平均OD值-空白组平均OD值)/(对照组平均OD值-空白组平均OD值)×100%。

1.7 统计学分析 应用SPSS16.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组P-AKT、AKT蛋白表达比较 LPS组P-AKt及AKt蛋白表达明显低于对照组(P<0.01)；与LPS组相比，LY+LPS组和LY组P-AKt/AKt蛋白显著下降(P<0.01)。各组AKt蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图1。

表1 各组P-AKt、AKt蛋白表达水平比较

与对照组比较:1)P<0.01;与LPS组比较:2)P<0.01;与 LY+LPS 组比较:3)P<0.01;同下表

图1 Western印迹测各组P-AKt、AKt蛋白表达

2.2 各组IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA比较 与对照组相比，LPS组IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA显著升高(均P<0.01)；与LPS组相比，LY+LPS组和LY组显著升高(P<0.01)；LY+LPS组IL-4、TGF-β mRNA略高于LY组，但差异无统计学意义(P>0.05)，而Nurr1 mRNA显著高于LY组(P<0.01)，见表2。

表2 各组IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA表达水平比较

2.3 各组PC12细胞存活率比较 与对照组(1.000±0.062)相比，LPS组PC12细胞存活率(0.816±0.052)显著下降(P<0.01)；LY+LPS组(0.935±0.048)显著高于LPS组(P<0.05)；LY组(0.975±0.096)与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

PD的病因及其发病机制尚不明确，但已明确炎症参与PD发病及其进展〔8〕。研究发现，PD患者中脑内IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎症因子含量升高〔9〕。小胶质细胞作为中枢神经系统内固有的神经免疫细胞，约占成人大脑细胞的12%，且有与巨噬细胞相似的功能。作为大脑内的第一道防御线，小胶质细胞在炎症反应中发挥重要作用。研究发现，PD患者大脑中存在大量激活的小胶质细胞〔10〕，激活后的小胶质细胞可以加速诱导iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症因子的表达，而这些因子都会伴随PD患者及各种PD模型中多巴胺能神经元的退变〔11〕。中脑又是小胶质细胞密集的区域，且小胶质细胞一旦激活就会长期存在，多巴胺能神经元对小胶质细胞介导的神经炎症过程比较敏感，小胶质细胞的激活可贯穿PD发病及其进程的整个过程。

近年来发现，PI3K/AKt信号通路与神经退行性疾病有关，在氧化应激及PD模型内存在抑制作用〔12，13〕，而神经保护类药物发挥神经保护作用也是与PI3K/AKt信号通路的激活有关，如川芎嗪类似物 CXC195在6-羟基多巴诱导的PD模型内通过激活PI3K/Akt/GSK3β来保护多巴胺能神经元的凋亡〔14〕；也有研究发现PI3K/AKt信号与PD的炎症机制联系紧密，E3泛素连接酶c-Cb1抑制小胶质细胞介导的中枢神经系统炎症与PI3K/AKt信号通路有关〔15〕，金银花的提取物类黄酮也可以通过PI3K/AKt信号通路来抑制BV2细胞诱导的炎症反应〔16〕。

本实验结果发现，炎症反应中P-AKt蛋白明显下降，PI3K/AKt信号通路被抑制，这与其他文献结果相似〔13〕，而LY也可以明显抑制信号通路；炎症反应中抗炎因子IL-4、TGF-β的表达水平升高，与其他研究结果相同〔17〕，LY预处理抑制该通路后，可以明显上调LPS诱导的IL-4、TGF-β表达，而单独抑制该通路，抗炎因子也是表达升高。Nurr1作为多巴胺能神经元形成的关键基因，其表达升高在体内和体外都有一定的抑炎作用，本文发现LPS刺激后Nurr1表达升高，与前期研究结果一致〔18〕，有无LPS刺激，抑制PI3K/AKt信号通路都能够上调Nurr1表达。本文结果发现，炎症反应液能够明显抑制PC12细胞的增殖，LY+LPS则能减弱PC12细胞的抑制增殖作用，使PC12细胞存活率增加。

综上所述，PI3K/AKt信号通路在炎症反应中存在一定的抑制作用，LY进一步抑制PI3K/AKt信号通路后，可以上调PD相关基因Nurr1及抗炎因子IL-4、TGF-β的表达，且对神经元细胞也有一定的保护作用。