糖尿病肾病患者血清miR-21、CysC与氧化应激指标的关系及其诊断价值

宋娜 苏东峰 高宇 刘晓燕 韩桂艳 李丽慧 刘畅

(承德医学院附属医院内分泌科，河北 承德 067000)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重的并发症，也是导致糖尿病患者死亡的主要原因〔1，2〕，在终末期肾病患者死亡原因中占第二位。血清胱抑素(Cys)C是评价肾功早期损伤的敏感指标，与血肌酐、尿素氮等指标比较更加稳定，不受炎症、肌肉含量等的影响，是反映糖尿病患者肾功能损伤的理想指标〔3〕。微小RNA(miR)是一类非编码小分子单链RNA，通过调控靶基因表达水平而广泛参与生物体内各种生理和病理过程，随着对miR研究的深入，有证据表明miR参与了糖尿病及其并发症的发生发展过程〔4〕，因而可将其作为糖尿病及其并发症诊断与治疗的靶点。本研究拟分析糖尿病患者miR-21与CysC和氧化应激指标间的关系及其诊断价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月至2017年1月在承德医学院附属院诊断为2型糖尿病并接受住院治疗的患者105例，男61例，女44例，年龄50～77〔平均(54.3±10.7)〕岁。纳入标准：①DN诊断符合世界卫生组织(WHO)糖尿病专家委员会推荐的糖尿病诊断标准〔5〕；②DN诊断依据Mogenson分期标准〔6〕；③本人或其家属自愿参加本研究，接受研究中使用的检验方法。排除标准：①已经确诊的1型糖尿病或其他类型糖尿病；②肾脏实变，其他原因导致的肾脏疾病，进行血液透析治疗的患者；③甲状腺功能异常、酮症酸中毒患者；④近期服用免疫抑制剂、肾脏毒性药物等影响肾脏功能的药物。

依据尿蛋白排泄率(UAER)将患者分为：A组：单纯糖尿病组，37例；B组：早期DN组，40例；C组：临床DN组，28例。另选30例在体检中心检查身体的健康者作为对照组，男女各半，平均年龄(52.9±11.5)岁，排除糖尿病、肾炎、代谢性疾病等。本研究经过医院伦理委员会审核通过，所有研究对象自愿参加并签署知情同意书。

1.2 诊断标准 糖尿病诊断标准：具有多饮、多尿、不明原因体重下降等典型糖尿病症状，随机血糖≥11.1 mmol/L，或者空腹血糖≥7.0 mmol/L，或者口服75 g葡萄糖后2 h血糖≥11.1 mmol/L。DN Mogenson分期：排除引起尿蛋白的其他原因(如肾炎、发热、泌尿系统感染)后，20 μg/min200 μg/min为临床DN。

1.3 检验方法 所有研究对象禁食8 h以上，并于入组后次日清晨采集空腹静脉血10 ml，分两管采集，一管在室温静置20 min后3 000 r/min离心15 min，分离得到血清分装至EP管中，保存于-80℃冰箱备用，带所有标本采集齐全后，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、NOX4、CysC的浓度，试剂盒购自美国R&D公司，操作严格按照说明书进行。另一管采用Trizol法提取血浆总RNA，采用美国Bio-Rad公司的RT-PCR试剂盒逆转录合成cDNA，采用Bio-Rad公司的SYBR定量PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测miR-21的表达，表达水平采用2-ΔΔCt法进行计算，引物和内参基因均通过GenBank检索得到，由Takara公司合成，mimics(内参)正义链：5′-GACTTCATCACCGGGTGTAAATC-3′，反义链：5′-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTGAC-3′；miR-21正义链：5′-ACGTTGTGTAGCTTATCAGACTG-3′，反义链：5′-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3′。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析和多重比较HSD-q检验。相关性分析采用Pearson相关分析，诊断价值分析采用受试者工作特征(ROC)分析。

2 结 果

2.1 氧化应激指标、CysC和miR-21比较 C组miR-21表达水平最低。C组SOD浓度和miR-21表达水平显著低于对照组和A、B组(均P<0.05)，C组MDA、NOX4、CysC浓度显著高于对照组和A、B组(均P<0.05)，其余组间比较结果见表1。

表1 不同组间氧化应激指标、CysC和miR-21比较

与对照组比较:1)P<0.05；与A组比较:2)P<0.05；与B组比较:3)P<0.05

2.2 相关性分析 以DN患者(B、C两组)资料为样本(n=68)，将其miR-21与CysC、氧化应激指标作相关性分析。结果DN患者miR-21与SOD呈正比(r=0.537)，与MDA、NOX4呈反比(r=-0.452，-0.518)，与CysC呈反比(r=-0.630)，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.3 ROC分析 将A、B、C 3组miR-21资料(共105例样本)建立ROC曲线分析模型，ROC曲线下面积(AUC)为0.802(0.95%CI=0.680～0.922)，理论阈值点C处miR-21水平为0.56(取整后)，对应的敏感度Se为0.765，特异度为0.760，均在0.76以上，提示miR-21确实有较好的早期DN的诊断价值，见图1。

图1 miR-21诊断DN的ROC曲线

3 讨 论

DN发病隐匿，早期DN没有明显症状，而此期肾损伤可以逆转，一旦发展为DN则不可逆转，因此早期及时诊断对于治疗和预后具有重要意义〔7，8〕。肾小球滤过率是评价肾功能的指标，临床上采用的金标准是99mTc-DTPA血浆清除率双血浆法，但检测方法复杂，应用不是很理想〔9〕。目前临床上常用UAER进行诊断，但易受尿量、酮症、尿路感染等因素影响，并且UAER出现异常时，患者已经发展到Ⅲ期，不够灵敏。血清CysC是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，所有有核细胞都能分泌，不受性别、年龄等因素影响〔10〕，并且肾脏是其唯一清除器官，因此其清除率主要由肾小球滤过率决定，能够灵敏反映肾脏损伤程度〔11〕。本研究也证实早期DN患者血清CysC浓度即显著升高，发展至DN时进一步升高。

在DN的发展过程中，血清CysC水平升高能够影响细胞的吞噬和趋化功能，激活氧化应激反应。氧化应激反应是DN发生的重要病理过程，血糖控制不良，糖基化终末产物增加促进氧自由基生成，引起肾小球内皮细胞、基底膜细胞等发生氧化损伤〔12〕。本研究对DN患者氧化应激指标检测发现，DN患者SOD水平降低，MDA和NOX4水平显著增加。生理状态下体内也会产生少量活性氧簇，但是很快会被体内的SOD、过氧化氢酶等清除，过量的活性氧会消耗SOD，氧化不饱和脂肪酸产生MDA。NOX4是NADPH氧化酶的一个主要催化亚基，具有催化活性氧生成的作用〔13〕，而NOX4的表达受到miRNAs调控，Fu等〔14〕首次发现miR-25通过调控NOX4的表达影响DN的发生过程，他们在体外研究中通过转染miR-25显著抑制了NOX4的表达，进而抑制NADPH氧化酶的活性，降低幅度达到51%。

此外，Dey等〔15〕发现糖尿病鼠模型的肾皮质中miR-21表达水平显著升高，进一步研究发现miR-21通过调控磷酸酶及张力蛋白同源基因PTEN的表达抑制其表达产物肿瘤抑制蛋白的表达，导致纤连蛋白表达增加，导致肾细胞肥大和纤连蛋白增加。本研究表明miR-21确实参与了DN的氧化应激过程，并且与体内氧化应激程度密切相关。而对miR-21与CysC的相关性分析显示二者呈负相关，与Zhang等〔16〕在DN小鼠模型上观察到的结果一致，提示miR-21高表达能够减少蛋白质排泄率，是DN的保护因素。

本研究发现单纯糖尿病患者血清miR-21较高，早期DN患者和DN患者血清miR-21水平显著降低，表明miR-21可能与肾小球滤过率相关，Szeto等〔17〕对DN患者尿沉渣miR-21表达量的研究也证实高水平的miR-21与患者血液透析生存期长密切相关，提示miR-21对于诊断DN包括早期DN具有重要价值。此点亦经ROC曲线分析予以证实。提示miR-21表达量可能是较好地诊断早期DN的敏感指标，其与糖尿病患者肾功能损伤、氧化应激状态具有密切关系，或可作为DN的潜在分子诊断指标。