KLF11过表达对H2O2诱导的H9c2心肌细胞活力及氧化应激水平的影响

王 滨,王文华,辛传友,郭龙哲,黄传奇，郜 阳,宁文龙

1)齐齐哈尔市第一医院急诊内科 黑龙江齐齐哈尔 161000 2)齐齐哈尔市第一医院风湿科 黑龙江齐齐哈尔 161000 3)哈尔滨医科大学附属第二医院重症医学科 哈尔滨 150000

氧化应激是指各种原因引起的机体活性氧(reactive oxygen species,ROS)蓄积过量，可引起细胞坏死，参与多种疾病的发生发展[1]。近些年的研究[2-3]显示，心肌细胞凋亡在心力衰竭、冠心病、心肌缺血再灌注等多种心血管损伤病理过程中发挥重要作用。自由基清除剂、抗氧化剂等可减轻氧化应激，降低心肌细胞凋亡率，从而改善心功能[4]。因此，探索氧化应激引起心肌损伤的作用机制将为心血管疾病的治疗提供极大的帮助。Kruppel样转录因子家族(Kruppel-like factors，KLF)是一个高度保守的转录因子家族。KLF11基因是KLF家族成员之一，参与细胞增殖、凋亡、周期等活动的调节[5]。有研究[6]显示，过表达KLF11可抑制小鼠心肌肥厚和纤维化，提示KLF11可能是心血管疾病治疗的一个分子靶点。本研究以大鼠H9c2心肌细胞为研究对象，观察过表达KLF11对过氧化氢(H2O2)诱导的H9c2细胞活力、凋亡的影响，并进一步探讨可能的分子机制。

1 材料方法

1.1试剂和仪器pcDNA3.1-KLF11及空载体pcDNA3.1购自上海生工生物工程有限公司。DMEM/F12培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素均购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；MTT试剂盒购自美国Sigma公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司；SOD检测试剂盒和MDA检测试剂盒均购自南京建成生物有限公司；BCA试剂盒购自中国碧云天公司；鼠抗人KLF11、PI3K、p-AKT、Bcl-2和GAPDH单抗均购自美国CST公司；酶标仪购自美国Thermo公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2H9c2细胞来源及转染H9c2细胞购自上海中科院细胞库，用含体积分数10%胎牛血清及青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基，在体积分数5%CO2、37 ℃培养箱中培养。细胞达80%～90%融合时，弃去旧培养基，PBS洗涤，加入胰蛋白酶消化1～2 min，倒置显微镜下观察。细胞由梭形变圆时终止消化，传代。取生长至对数期的第3代细胞用于后续实验。将细胞接种于6孔板(2×105个/孔)，常规培养，融合度达50%～70%时，分别转染pcDNA3.1-KLF11及pcDNA3.1，操作参考Lipofectamine 2000试剂盒说明。采用Western blot法检测未转染细胞、转染pcDNA3.1-KLF11或pcDNA3.1的细胞中KLF11蛋白的表达，确定转染效果。KLF11一抗稀释度1∶500，以GAPDH为内参。

1.3实验分组实验分4组。空白组：常规培养H9c2。H2O2组：采用200 μmol/L的H2O2处理H9c2细胞6 h。空质粒+H2O2组：pcDNA3.1转染H9c2细胞48 h后，采用200 μmol/L的H2O2处理细胞6 h。KLF11+H2O2组： pcDNA3.1-KLF11转染H9c2细胞48 h后，采用200 μmol/L的H2O2处理细胞6 h。

1.44组细胞活力的测定以1×104个/孔接种H9c2细胞于96孔板，细胞长至80%～90%时，按照1.3分组处理后，MTT法测定细胞活力。每孔加5 g/L的MTT试剂20 μL，37 ℃培养箱中孵育4 h，吸弃上清，每孔加入150 μL的DMSO室温振荡10 min，使结晶能够充分溶解。用酶标仪测定490 nm波长处的吸光度(A)，以A值反映细胞活力。每组设置5个复孔，实验重复3次。

1.54组细胞凋亡率的检测按照1.3分组处理细胞后，收集细胞，用PBS洗涤，以不含EDTA的胰蛋白酶消化1～2 min，待细胞由梭形皱缩变圆时，终止消化，吹打细胞成细胞悬液，收集于离心管中，4 ℃条件下1 000 r/min离心10 min，弃上清，PBS洗涤细胞。收集(1～5)×105个细胞，加1×Binding buffer 500 μL悬浮，再加5 μL的Annexin V-FITC及5 μL的 PI，混匀，室温下避光反应5～15 min，1 h内上流式细胞仪检测。每组设置3个复孔，实验重复3次。

1.64组细胞中SOD活力及MDA含量检测分组处理细胞后，采用SOD检测试剂盒及MDA检测试剂盒检测细胞中SOD活力及MDA含量。实验重复3次。

1.74组细胞中PI3K、p-AKT和Bcl-2蛋白表达的检测分组处理结束后，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按照4∶1的比例将蛋白样品与上样缓冲液混匀于EP管中，煮沸变性5 min。每孔蛋白上样40 μg，经SDS-PAGE分离，电泳后电转PVDF膜，将膜用50 mL的50 g/L脱脂奶粉溶液于37 ℃封闭2 h。弃掉封闭液，加入经封闭液稀释的一抗(1∶500稀释的PI3K、p-AKT或Bcl-2抗体，1∶1 000稀释的GAPDH抗体)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加经封闭液稀释的HRP标记的二抗(1∶2 000稀释)，于37 ℃恒温箱中孵育1 h，洗膜。暗室中ECL显色、显影。用Quantity One分析各蛋白条带灰度值。以目的蛋白与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。实验重复3次。

1.8统计学处理数据采用SPSS 21.0进行分析，3组间KLF11蛋白表达水平的比较，4组细胞活力、凋亡率、SOD活力、MDA含量、PI3K、p-AKT和Bcl-蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1转染效果见图1。未转染细胞、pcDNA3.1转染细胞和pcDNA3.1-KLF11转染细胞中KLF11蛋白表达水平分别为(0.102±0.011)、(0.109±0.012)和(0.476±0.051)，3组比较差异有统计学意义(F=143.727，P<0.001);pcDNA3.1-KLF11转染细胞KLF11蛋白表达高于未转染细胞和pcDNA3.1转染细胞(P<0.05)，说明pcDNA3.1-KLF11转染效果显著。

1、2、3：分别为未转染细胞、pcDNA3.1转染细胞和pcDNA3.1-KLF11转染细胞

图13组H9c2细胞中KLF11蛋白的表达

2.24组细胞活力和凋亡率的比较见表1。与空白组比较，H2O2组细胞活力降低，凋亡率增加；与H2O2组比较，KLF11+H2O2组细胞活力增加，凋亡率降低。

表1 4组细胞活力和凋亡率的比较

*：与空白组比较，P<0.05；#：与H2O2组比较，P<0.05

2.34组细胞SOD活力和MDA含量的比较见表2。与空白组比较，H2O2组细胞SOD活力降低，MDA含量增加；与H2O2组比较，KLF11+H2O2组细胞SOD活力增加，MDA含量降低。

表2 4组细胞SOD活力和MDA含量的比较

*：与空白组比较，P<0.05；#：与H2O2组比较，P<0.05

2.44组细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平的比较结果见图2和表3。H2O2组细胞PI3K、p-AKT和Bcl-2表达均较空白组降低，而KLF11+H2O2组细胞PI3K、p-AKT和Bcl-2表达较H2O2组升高(P<0.05)。

1、2、3、4：分别为空白组、H2O2组、空质粒+H2O2组、KLF11+H2O2组

图2 4组H9c2细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达

*：与空白组比较，P<0.05；#：与H2O2组比较，P<0.05

3 讨论

研究[7]表明，氧自由基(也称ROS)参与多种心血管疾病的病理进程。ROS可由活化的心肌细胞、中性粒细胞等产生。当机体ROS过量产生时，可引起线粒体脂质过氧化，抑制线粒体功能，最终导致心肌ATP生成减少[8]，可引起心肌细胞损伤。此外，ROS过量产生还可导致细胞内DNA断裂，破坏核酸，引起染色体畸变，最终导致细胞死亡[9]。有研究[10]发现，200 μmol/L的H2O2处理H9c2细胞，细胞存活率约为50%，提示该浓度H2O2能兼顾适量的细胞死亡率及氧化应激损伤，因此本研究中选择该浓度为诱导剂量。

KLF11基因是KLF基因家族成员之一，在肝脏、肌肉、胰腺等多种组织中广泛表达，参与细胞糖脂代谢、增殖等多种生理病理过程。目前对KLF11的研究多集中于肿瘤方面，在心血管方面的研究极少。有研究[11]显示，KLF11对缺血损伤后的脑血管有保护作用，过表达KLF11可抑制小鼠心肌肥厚和纤维化[6]，提示KLF11在心血管疾病进程中有重要作用。本研究结果显示，H2O2可诱导心肌细胞H9c2凋亡，提高其氧化应激水平，表现为细胞内SOD活力降低，MDA含量增加；而过表达KLF11可提高H2O2诱导的H9c2细胞中SOD活力，降低MDA含量。提示KLF11对心肌细胞损伤的保护作用与降低氧化应激水平有关。

PI3K/AKT是细胞内一条重要的信号途径，广泛参与细胞增殖、凋亡、分化等生物学过程的调控。AKT是PI3K下游的重要激酶，被磷酸化激活后可通过调节下游的一系列靶蛋白，参与细胞生物学过程的调控[12-13]。已有大量研究[14-15]表明，激活PI3K/AKT信号通路对心肌损伤有保护作用。本研究Western blot法检测结果显示，H2O2可降低H9c2细胞中PI3K、p-AKT和Bcl-2的表达水平，而过表达KLF11可增强H2O2诱导细胞中PI3K、p-AKT和Bcl-2表达。提示KLF11可能通过激活PI3K/AKT信号通路，减弱氧化应激引起的心肌细胞损伤。

综上所述，KLF11可减弱H2O2对H9c2细胞的活力抑制、凋亡促进作用，机制可能与抑制氧化应激和激活PI3K/AKT信号通路有关。KLF11可能是心血管疾病治疗的有效靶点之一。