UPLC-MS/MS法测定四种果蔬中草铵膦残留量

施 雅

(上海必诺检测技术服务有限公司，上海 200436)

草铵膦(glufosinate)的化学名称为：DL-甲基-(3-氨基-3-羧基丙基)膦酸铵,是拜耳公司研究开发的具有部分内吸作用的非选择性、触杀性除草剂，是高效、低毒、大吨位使用的旱地除草剂[1]。作为除草剂，草铵膦几乎能有效除去各种供试杂草，并且对农作物安全，药害小，是目前转基因抗性作物理想的除草剂，应用前景广阔[2-4]。尽管草铵膦属于非持久性农药，但大量和过量使用仍有可能在农作物上农药残留，从而对人类健康产生严重危害和影响[5-6]。目前包括欧盟、美国、日本、加拿大、中国等国均对草铵膦均提出了最大限量要求，限量范围在0.02～8 mg/kg[7]。

草铵膦的检测方法主要包括液相色谱法[8-9]、离子色谱法[10]、毛细管电泳法[11]、液相色谱-串联质谱法[12-13]等等。本实验采用UPLC-MS/MS法，UPLC-MS/MS结合了色谱的分离技术的和质谱的高选择性，加入同位素内标消除基质效应，柱前衍生提高质谱响应值，实现了对于苹果、哈密瓜、青菜、白菜四种果蔬中草铵膦残留的快速检测。该方法试剂成本低，结果准确、操作简便，灵敏度高，能够满足四中果蔬中草铵膦的检测要求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

乙腈：色谱纯，国药集团；甲酸、乙酸铵：优级纯，国药集团；FOMC-Cl、四硼酸钠：分析纯，美国 Sigma公司；草铵膦标准品：纯度﹥97.5%，购自Dr.Ehrenstorfer公司；草铵膦-d3标准品：纯度﹥99% ，加拿大TRC公司。标准溶液配制：称取适量标准品，用水溶解，标准储备溶液浓度为1.0 mg/mL。 0～4℃冷藏避光保存。上述储备液0.1 mL，用水定容至10 mL，溶液浓度为10 μg/mL的标准工作溶液(现配现用)。

内标溶液配制：称取适量标准品，用水溶解，储备液溶液浓度为100 μg/mL。0～4℃冷藏避光保存。去上述储备液1 mL，用水定容至10 mL，溶液浓度为10 μg/mL的标准工作溶液(现配现用)。

1.1.2 仪器设备

超高效液相色谱-串联质谱仪配有电喷雾离子源，美国安捷伦公司；匀浆机：JJ-2型，金坛市城西峥嵘实验仪器厂；高速冷冻离心机：Sorvall ST16R型，赛默飞世尔公司；涡旋震荡器：Basic Vortex Mixer型，美国Talboys公司；氮吹仪：ANPEL DC12型，上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

提取：称取5 g试样(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入40 μL 10 μg/mL的d3-草铵膦同位素内标和10 mL水，震荡提取30 s，用匀浆机在15000 r/min，匀浆提取1 min，于8000 r/min离心5 min，取上清液5 mL至8 mL，待净化。

净化：C18小柱经5 mL甲醇和5 mL水活化后，将上述提取液正向通过C18小柱，弃去前2 mL洗脱液，收集后3 mL至5 mL流出液，待衍生。

衍生：取上述净化后提取液600 μL，加入200 μL 1.0 mg/mL FMOC-Cl丙酮溶液和200 μL 30 g/L四硼酸钠溶液，混匀，室温下进行衍生化反应，放置过夜。过0.22 μm水相滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。

标准液衍生：取适量混合标准溶液600 μL，加入200 μL 1.0 mg/mL FMOC-Cl丙酮溶液和200 μL 30 g/L四硼酸钠溶液，混匀，室温下进行衍生化反应，放置过夜，过0.22 μm水相滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。

1.2.2 超高效液相色谱条件

色谱柱：Eslipse plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm粒径)；流动相：0.1%甲酸水溶液(v/v)+乙腈(梯度洗脱见表1)；流速：0.4 mL/min；柱温：30℃；进样量：3.0 μL。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.2.3 串联质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应检测；雾化器温度：350℃雾化器流量：12 L/min；鞘气温度：400℃；鞘气流量：12 L/min；定性、定量离子对及对应的碎裂电压和碰撞能量见表2。

表2 草铵膦的质谱参数

注：a 定量离子。对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。

2 结果讨论

2.1 净化方法的优化

实验比较了C18固相萃取柱、MCX固相萃取柱、HLB对草铵膦回收率的影响，结果见图1。由图1可知，C18固相萃取柱的净化效果好。MCX、HLB在正相净化过程中吸附了部分目标化合物，导致了目标化合物回收率的不稳定和下降。C18填充物为非极性物质，对于强极性草铵膦吸附性弱，并且能够有效分离目标化合物和杂质，所以选择C18固相萃取柱净化样品。

图1 固相萃取柱对净化效果的影响

2.2 分析方法线性范围考察

分别选取苹果、哈密瓜、青菜和白菜四种样品，按照前处理方法，采用所得到的基质溶液配制标准曲线，标准曲线浓度分别为0 ng/mL、10～500.0 ng/mL，再经过衍生，经液相色谱-串联质谱仪检测，以标准溶液中被测组分峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，以被测组分浓度为横坐标，绘制标准曲线，在四种基质中草铵膦相应的回归方程及相关系数见表3。

表3 草铵膦在四种果蔬基质加标的回归方程和相关系数

由表3可知，在0～500 ng/mL范围内草铵膦浓度与其色谱峰面积响应值呈良好的线性关系。草铵膦标准溶液的多级反应监测(MRM)色谱图见图2。由图2表明，10 ng/mL的草铵膦响应值良好。

图2 草铵膦标准品的MRM色谱图

Fig.2 MRM chromatogram of glufosinate standards

2.3 准确度和精密度

按本方法确定的条件，选择苹果、哈密瓜、青菜、白菜四种果蔬作为基质样品，进行50、100、500 μg/kg三个水平的添加回收试验，各水平进行6次平行测定，回收率和精密度见表4。

表4 草铵膦在不同果蔬中加标回收率及精密度测定结果

由表4可知，在这四种果蔬中添加不同含量的草铵膦，其平均回收率达到85.5%～97.4%，相对标准偏差小于10%，表明该方法对不同样品和不同含量的草铵膦的测定均具有很好的准确度和精密度。

3 结论

本实验建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定四种果蔬中草铵膦的检测方法。草铵膦属于强极性化合物，采用纯净水提取，经过C18固相萃取柱净化，消除了色素、脂类物质的干扰，经过衍生后，再应用Agilent Eclipse plus C18色谱柱分离，采用多反应监测模式，电喷雾串联四级杆质谱进行检测，内标法定量，实现了对草铵膦定性、定量测定。该检测方法成本低廉、方法简单、快速、定性定转准确，能够满足四中果蔬中草铵膦残留的检测。