天然磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂的筛选

杨立军，杨中铎

(兰州理工大学 生命科学与工程学院， 甘肃 兰州 730050)

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)属于一个家族信号转导酶，这些脂质激酶的主要作用是特异性地催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)的3-位羟基磷酸化，生成有第二信使作用物质的磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯(PIP3)参与多种生物过程的调节，包括细胞生长、生存、增殖、迁移、存活和细胞内运输[1-3]。PI3Ks根据其基因序列，同源性和体外脂质底物特异性，被分为3个不同的类别(I类，II类和III类)。其中，研究最广泛的为I类PI3K,此类PI3K为异源二聚体，由1个调节亚基和1个催化亚基组成，I类PI3K进一步分为IA类(包括PI3K-α，β和δ)和IB类2组，其仅包含1个成员PI3K-γ[4]。PI3K和其下游分子Akt所组成的信号通路可以激活下游信号分子，该信号分子在众多的肿瘤发生发展过程中起至关重要的作用[5]，因此，PI3K抑制剂日益成为肿瘤研究者关注的一个研究热点，被认为是设计肿瘤特异性药物的潜在靶点[6]。

目前，WELKER等[7-8]利用天然产物分离、化学合成等手段研究发现，Wortmannin类化合物、黄酮类化合物、二萜类化合物、嘧啶类化合物、喹唑啉类化合物、吡啶类化合物、喹啉类化合物、吲哚类化合物、喹喔啉类化合物、吡嗪类化合物、氮杂茂类化合物和三嗪类化合物等不同类型的PI3K抑制剂。这些抑制剂除Wortmannin类化合物外，大多为合成药物，目前报道的天然PI3K抑制剂还十分少见。为了获得天然的PI3K抑制剂，对40种植物的总生物碱提取物和12种天然viridin类似物(与Wortmannin结构相似)的PI3K抑制活性进行筛选，以期为肿瘤特异性药物研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药材 40种中药材样品，均购自兰州黄河药材市场安宁医药公司复兴厚药庄，标本保存于兰州理工大学生命科学与工程学院，由兰州理工大学鉴定。12种viridin类似物，均为研究小组从踝节菌属真菌(TalaromyceswortmanniiLGT-4，GenBank Accession No.KF850714)中分离得到，该菌为雷公藤(Tripterygiumwilfordii)中分离的1株内生菌[9]。其中，化合物1～4由丁海娥[9]分离得到，化合物5由孙景云[10]分离得到，化合物6由智康康[11]分离得到，化合物7～12由傅广超[12-13]分离得到。

1.1.2 仪器 HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，RE-52CS型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，PHSJ-3D 型pH计(上海雷磁)，多功能酶标仪Spark 10M(瑞士帝肯Tecan)，384孔酶标板(美国Corning Costar公司)，移液枪(Eppendorf)。

1.1.3 药品与试剂 磷酯酰肌醇-3-激酶(PIK3CA/PIK3R1，20 μg)，底物(PIP2:PS Lipid Kinase Substrate, 400 nmol，Thermo Fisher Scientific)，ADP-GloTMKinase Assay试剂盒(Promega)，GDC-0941( 阿拉丁)。

1.2 试验方法

1.2.1 总生物碱的制备 取中药材粉碎，每100 g样品粉末用700 mL的95%乙醇水浴回流提取2次，每次2 h。抽滤，合并滤液，滤液在减压条件下回收乙醇得浸膏。浸膏被悬浮在100 mL蒸馏水中，悬浮溶液用2 mol/L HCl调pH至2.0～3.0。静置过夜后，抽滤，滤液用浓氨水调pH至10.0～11.0，立刻用等体积的氯仿萃取3次，合并有机相，减压条件下回收氯仿得到总生物碱提取物。此生物碱提取物用于PI3K抑制活性的评价。

1.2.2 PI3K抑制活性的测定 采用体外激酶测定方法测定化合物的PI3K抑制活性，PI3K酶的活性通过测量激酶反应后产生的ADP的量来确定[14]。试验均在室温下的384孔板中进行。

具体实施步骤：配置激酶缓冲液，其中包括50 mmol/L Hepes (pH7.5)，3 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EGTA, 0.03% CHAPS 和2 mmol/L DTT。PI3K激酶使用激酶缓冲液稀释到0.9 ng/μL。配置ATP/底物混合物，其中包括5 μmol/L PIP2/PS和25 μmol/L ATP。待测化合物用100%的DMSO稀释到10 mmol/L。向384孔板中的每个孔中加入2 μL稀释的化合物和4 μL的ATP/底物混合物。之后在各个孔中加入4 μL的PI3K激酶混合液后避光下反应1 h。之后在每个孔中加入10 μL ADP-GloTM试剂，孵育40 min后在每个孔中加入20 μL激酶检测试剂(Kinase Detection Reagent)，遮光反应30 min。最后在多功能酶标仪中测量化学发光值，计算抑制率。

抑制率=[1-(化合物组-阳性对照组)/(空白组-阳性对照组)]×100%

其中，空白组用2 μL激酶缓冲液代替2 μL待测样品液，阳性对照组用2 μL GDC-0941(10 mmol/L)代替2 μL待测样品液，GDC-0941为阳性对照药品，其IC50为(4.5±0.2) nmol/L。

样品对PI3K的半数抑制浓度(IC50)是通过测定样品不同浓度(50.0 μg/mL、25.0 μg/mL、12.5 μg/mL、3.1 μg/mL、1.5 μg/mL、0.7 μg/mL、0.3 μg/mL和0.1 μg/mL)下的抑制率，最后通过直线回归法计算出待测样品的IC50。每个样品均做3次平行，取其平均值。

2 结果与分析

2.1 40种中药材总生物碱提取物对PI3K的抑制活性

从表1看出，槲寄生、马齿苋、粉防己、大青叶和川芎的的总生物碱对PI3K具有明显的抑制活性，其总生物碱在质量浓度为50 μg/mL时对PI3K的抑制率分别为81.0%、80.8%、80.7%、86.6%和77.5%，IC50分别为8.8 μg/mL、20.6 μg/mL、8.6 μg/mL、9.9 μg/mL和0.1 μg/mL。麻黄根、莱菔子、款冬花、知母和平贝母的抑制率为50.5%～61.7%，对PI3K具有中等抑制活性。其余植物总生物碱对其抑制活性很弱或无。

表1 40种中药材总生物碱提取物对PI3K的抑制活性

续表1

编号No.药材名称Name拉丁名Latin name抑制率/%Inhibition ratioIC50/(μg/mL)16半夏Pinellia ternata49.3Nd17莱菔子Raphanus sativus51.1Nd18马齿苋Portulaca oleracea80.820.619粉防己Stephania tetrandra80.78.620苦参Sophora flavescens29.6Nd21百部Stemona sessilifolia42.2Nd22白头翁Pulsatilla ambigua18.0Nd23款冬花Tussilago farfara60.3Nd24知母Anemarrhena asphodeloides61.7Nd25平贝母Fritillaria ussuriensis59.1Nd26白蒺藜Tribulus terrestris31.8Nd27芥子Brassica alba13.7Nd28胡椒Piper nigrum29.5Nd29大青叶Isatis indigotica86.69.930元胡Corydalis humosa8.8Nd31郁金Curcuma aromatica6.9Nd32密蒙花Buddleja officinalis23.8Nd33青风藤Sabia japonica17.5Nd34麻黄草Ephedra sinica7.4Nd35金银花Desmodium styracifolium7.8Nd36鸡骨草Abrus cantoniensis12.8Nd37桑叶Morus nigra17.8Nd38板蓝根Rhizome of Isatis indigotica2.3Nd39槟榔Areca catechu41.2Nd40川芎Ligusticum chuanxiong77.50.1

2.2 12种天然化合物对PI3K的抑制活性

从表2看出，化合物12(Wortmannine C)对PI3K具有明显抑制活性，其质量浓度为20 μg/mL时,对PI3K的抑制率为74.8%，IC50为6.8 μg/mL。其余化合物对其抑制活性很弱或无。

表2 12种天然化合物对PI3K的抑制活性

3 结论与讨论

研究发现，槲寄生、马齿苋、粉防己、大青叶和川芎的的总生物碱对PI3K具有明显的抑制活性，其总生物碱在质量浓度为50 μg/mL时，对PI3K的抑制率分别为81.0%、80.8%、80.7%、86.6%和77.5%，IC50分别为8.8 μg/mL、20.6 μg/mL、8.6 μg/mL、9.9 μg/mL和0.1 μg/mL。化合物12(Wortmannine C)对PI3K具有明显的抑制活性，其质量浓度为20 μg/mL时，对PI3K的抑制率为74.8%，IC50为6.8 μg/mL。

川芎嗪通过酯键与丹参素偶联形成的DT-010可以通过激活PI3K/Akt/GSK3b途径增强肌细胞增强因子2D，从而预防1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的神经毒性[15]，但DT-010是川芎嗪与丹参素偶联形成的化合物，所以目前并没有研究川芎的生物碱对PI3K的抑制活性。从马齿苋中分离得到的(E)-5-羟基-7-甲氧基-3-(2'-羟基苄基)-4-苯并二氢吡喃酮可以通过激活3T3-L1脂肪细胞中的PI3K/Akt和AMPK途径刺激GLUT4易位至质膜来增加葡萄糖摄取[16]。目前并没有研究马齿苋的生物碱对PI3K的抑制活性。粉防己碱通过下调Rac1、Cdc42、RhoA、GTPases和RacA的表达和激活PI3K/Akt和JNK信号通路可显著抑制类风湿性关节炎纤维样滑膜细胞的迁移和入侵[17]；汉防己乙素可以通过抑制SGC7901细胞中的PI3K/AKT信号通路而抑制肿瘤细胞的生长繁殖和侵袭[18]。目前研究最多的是粉防己碱的药理活性，而粉防己碱中含有大量生物碱，其PI3K活性成分，有待进一步深入研究。目前未见有关槲寄生和大青叶总生物碱对PI3K抑制活性的研究。

化合物12(Wortmannine C)是项目组从踝节菌属真菌(Talaromyces wortmannii)中分离出来的一个具有五元B环的呋喃甾体类化合物，其具有新颖的骨架结构，属于wortmannin的衍生物，也是viridin类化合物家族的一员[12]。经研究发现，该化合物对PI3K具有良好的抑制活性，将是一个新的先导物，值得进一步深入研究。