偶联维生素B12基团的阳离子糖原衍生物

毛旭宏，林坤华，张黎明，杨立群

(中山大学材料科学与工程学院∥中山大学化学学院∥聚合物复合材料及功能材料教育部重点实验室∥广东省高性能树脂基复合材料重点实验室，广东 广州510275)

与线性高聚物相比，超支化高聚物具有高溶解度、低粘度等特点，并在支化末端含有大量可反应的活性基团[1-3]。更重要的是超支化高聚物在水溶液中通常采用球形构象，其松散的超支化结构空腔能够负载药物客体分子，因此，近年来超支化高聚物的合成及其在生物材料领域受到了极大的关注[3-8]。然而，一些合成的超支化高聚物由于缺乏生物安全性、可降解性等缺陷而难以在生物医学领域得到应用[7-8]。

天然多糖安全无毒、具有较好的生物相容性和降解性且含有可反应的活性基团(如—OH、—COOH和—NH2)，因而在生物材料领域备受关注[9]。作为一种贮存能量的天然超支化多糖，糖原主要存在于哺乳动物的肝脏和肌肉以及贝类生物体中[10]。糖原具有较高绝对分子量和超支化拓扑结构的特点：每个糖原分子由约30 000～55 000个葡萄糖单元通过α-1,4和α-1,6糖苷键连接而成，绝对分子量高达106～107g/mol，大约每10～14个葡萄糖单元出现一个支化点，形成一种超支化的拓扑结构[11-12]。Rolland-Sabaté等根据高分子稀溶液理论证实糖原在水溶液中呈现一种紧密球形构象[11]。Burchard通过透射电镜观察到家兔肝脏糖原在聚集形成粒径约为160 nm的玫瑰花状聚集体[13]。据文献[14]报道，人体内肌糖原和肝糖原聚集体的粒径分别为10～44 nm和110～290 nm。由于糖原能被糖原磷酸化酶、糖原脱支酶和磷酸葡萄糖变位酶降解[14]，所以，将糖原研究开发成为一种安全高效的纳米药物传输载体具有一定的应用价值。

对于长期需要肌肉注射达到疗效的药物，不仅给患者带来身体和精神上的痛苦，而且常出现有注射部位肌肉萎缩等后遗症。口服纳米粒作为一种极具潜力的新兴给药技术，不仅能够提高患者的顺应性，减少口服药物对胃肠道的刺激性，而且可以提高口服纳米粒被小肠靶向吸收的效率，从而提高口服药物的生物利用度[15]。研究发现关于口服纳米粒胃肠道吸收机制和吸收途径主要有以下几种[16-18]：细胞旁路通道转运、肠道上皮细胞跨胞摄取、经回肠内集合淋巴结(peyer’s patches, PP)的微皱褶细胞 (microfold cells，M细胞)吞噬。为了进一步增强纳米粒被小肠吸收的效率，通常在制备纳米粒的载体分子中偶联维生素V12(VB12)。其机理是[19-20]，VB12与胃产生的造血内因子(intrinsic factor)结合形成复合物，随后进入小肠，与小肠壁表面的造血内因子受体特异性相结合，促使VB12内化吸收，从而使得偶联VB12基团的纳米粒被小肠定位吸收来提高胃肠道对纳米粒的摄取。

目前研究报道较多的用于制备高效小肠吸收纳米粒的聚合物主要是聚N-异丙基丙烯酰胺[21]、聚甲基丙烯酸[22]、壳聚糖[22]和海藻酸钠[23]等，尚未见有关研究糖原口服纳米粒的工作。基于上述糖原的特点，为了开发其在口服纳米药物传输领域的新应用途径，本工作合成偶联维生素B12基团的阳离子糖原衍生物(图1)，通过红外光谱法(FTIR)和核磁共振氢谱法(1H NMR)分析其结构，研究其在模拟胃液和小肠液中的稳定性及被糖原磷酸化酶a降解的性能。

图1 GD和GD-VB12衍生物的合成路线Fig.1 Synthesis route of the GD and GD-VB12 derivatives

1 实验部分

1.1 主要原料及试剂

糖原(glycogen，来源于牡蛎)购于Sigma-Aldrich Co. Ltd(St. Louis, MO, USA),糖原磷酸化酶a(glycogen phosphorylase a)购于Sigma-Aldrich Co. Ltd(St. Louis, MO, USA)，二乙烯三胺(DETA，纯度φ=99%)购于上海麦克林生化科技有限公司，维生素B12(VB12，纯度w=98%)和N，N′-羰基二咪唑(CDI，纯度w=98%)购于上海萨恩化学技术有限公司，胃蛋白酶(来源于猪胃)和胰酶(来源于猪胰腺)购于上海阿拉丁试剂公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 阳离子糖原衍生物(GD)的合成

采用N,N′-羰基二咪唑(CDI)活化法[24]，将100 mg(0.62 mmol葡萄糖单元)糖原溶解于10 mL 干燥的DMSO，在氮气保护下加入0.35 g(2.16 mmol)CDI，室温下搅拌进行活化反应1 h，得到CDI活化的糖原中间物。然后加入DETA(1.5 g，15 mmol)，在氮气保护下室温反应24 h。反应结束后，将反应液置于蒸馏水中透析3天(透析袋截留相对分子质量8 000～14 000)，冷冻干燥得到的产物命名为GD。

FTIR测试：采用KBr压片法进行测试，仪器为红外光谱仪测试(Thermo Nicolet Nexus 670, Waltham, MA, USA)，扫描范围为400～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描32次。

1H NMR测试：将样品溶于D2O进行测试，仪器为500兆赫超导核磁共振谱仪(Varian INOVA 500 NB, Salt Lake City, UT, USA)，扫描256次，以HDO在化学位移值为4.67处的峰定为内标。

1.3 偶联VB12基团的阳离子糖原衍生物(GD-VB12)的合成

称取11.64 mg VB12(0.86×10-2mmol)搅拌溶解于10 mL干燥的DMSO，在氮气保护下加入2.79 mg CDI (1.7×10-2mmol)，于室温下进行避光活化反应2 h。称取GD 0.1 g(0.344 mmol氨基葡萄糖单元)搅拌溶解于50 mL干燥的DMSO，待溶解充分后向体系滴加经CDI活化的VB12，然后在无水氮气氛围室温避光反应24 h。反应结束后，将反应液置于蒸馏水中透析3 d(透析袋截留相对分子质量8 000～14 000)，冷冻干燥得到的产物命名为GD-VB12。采用1H NMR法分析其结构。

UV-vis测试：根据参考文献[20]，采用吸收光谱法测定GD-VB12衍生物的VB12基团取代度(定义为糖原分子中平均每个糖单元上含有VB12基团的数目)，仪器为PerkinElmer UV750分光光度计(美国PE公司，Waltham, MA, USA)，扫描范围为250～650 nm，VB12的检测波长为360 nm。以蒸馏水为溶剂，分别配制不同浓度的VB12溶液(1～50 μg/mL)，进行UV-vis测试，制定工作曲线(公式1)。用相同溶剂配制GD-VB12衍生物溶液(100 μg/mL)，测定其VB12基团的取代度。

A=0.027C-0.002 (R2=0.999 9)

(1)

式中，A为360 nm处对应的吸收峰的吸光度，C为溶液中VB12的浓度。

1.4 糖原衍生物的微观形态

将铝箔通过导电胶粘贴在扫描电镜载物台，滴加GD和GD-VB12衍生物溶液(5 mg/mL)，冷冻干燥，喷金，用Quanta 400F热场发射环境扫描电镜(美国FEI公司，Hillsboro, OR，USA)观察样品的微观形态。

1.5 糖原及其衍生物在模拟胃液的稳定性能测试

1.5.1 碘显色法定量测定糖原及其衍生物在模拟胃液中的稳定性 根据《中国药典》及文献方法配制模拟胃液并进行测试[25-26]：称取糖原(250 mg)、GD(25 mg)及GD-VB12(25 mg)，分别加入50 mL模拟胃液(含10 mg/mL胃蛋白酶的盐酸溶液，pH=1.2)，室温搅拌后置于37 ℃水浴恒温箱中振荡1、2、3 h，将混合溶液离心10 min(8 000 r/min)，收集上清液。取0.5 mL上清液，滴加0.5 mL I2-KI显色剂(含0.26 mg/mL I2和 2.6 mg/mL KI的水溶液)[27]，室温混合均匀后，采用上述PerkinElmer UV750分光光度计进行测试，扫描范围为350～600 nm，测试波长λ=400 nm。根据公式(2)计算糖原及其衍生物在模拟胃液中的保留率(即经过含有胃蛋白酶及无胃蛋白酶的模拟胃液处理后糖原及其衍生物的量之比)。重复三次实验。

保留率/%= (A/A0) × 100

(2)

式中，A和A0分别为糖原及其衍生物在含有胃蛋白酶及无胃蛋白酶的模拟胃液中加入I2-KI显色剂的吸光度。

1.5.2 银镜反应法定性研究糖原及其衍生物在模拟胃液中的稳定性 银氨溶液的配制[28]：在试管中加入5 mLw=2%的AgNO3溶液，滴加2滴0.1 mol/L NaOH溶液，生成黑色沉淀后，再逐滴滴加φ=2%氨水至沉淀恰好消失为止。

称取10 mg糖原、GD、GD-VB12，分别加入5 mL模拟胃液溶解；另外设置对照组，即称取10 mg葡萄糖和糖原，分别加入5 mL不含胃蛋白酶的模拟胃液溶解。将上述溶液置于37 ℃水浴恒温箱中振荡3 h，然后加入5 mL新配制的银氨溶液，70 ℃水浴加热3 min，拍照。

1.6 糖原及其衍生物在模拟小肠液的稳定性能测试

1.6.1 碘显色法定量测定糖原及其衍生物在模拟小肠液中的稳定性 根据《中国药典》及文献方法配制模拟小肠液并进行测试[25-26]。称取糖原(250 mg)、GD(25 mg)及GD-VB12(25 mg)，分别加入50 mL模拟小肠液(含10 mg/mL胰酶的PBS溶液，pH=6.8)，室温搅拌后置于37 ℃水浴恒温箱中振荡1、2、3、4 h，将混合溶液离心10 min(8 000 r/min)，收集上清液。取0.5 mL上清液，滴加0.5 mL I2-KI显色剂，采用上述分光光度法及公式(2)方法测定糖原及其衍生物在模拟小肠液中的保留率。重复三次实验。

1.6.2 银镜反应法定性研究糖原及其衍生物在模拟小肠液中的稳定性 称取10 mg糖原、GD、GD-VB12，分别加入5 mL模拟小肠液溶解；另外设置对照组，即称取10 mg葡萄糖、糖原，分别加入5 mL不含胰酶的模拟小肠液溶解。将上述溶液置于37 ℃水浴恒温箱中振荡4 h，然后加入5 mL新配制的银氨溶液，70 ℃水浴加热3 min，拍照。

1.7 糖原衍生物被糖原磷酸化酶a降解的性能测试

1.7.1 碘显色法定量测定糖原及其衍生物在糖原磷酸化酶a溶液中的降解性能 称取糖原(250 mg)、GD(25 mg)及GD-VB12(25 mg)，分别加入50 mL糖原磷酸化酶a溶液(200 μg/mL，PBS(pH=6.8))，室温搅拌后置于37 ℃水浴恒温箱中振荡1、2、3、4 h，将混合溶液离心10 min(8 000 r/min)，收集上清液。取0.5 mL上清液，滴加0.5 mL I2-KI显色剂，采用上述分光光度法进行测试。

1.7.2 银镜反应法定性研究糖原及其衍生物在糖原磷酸化酶a溶液中的降解性能 称取10 mg糖原、GD、GD-VB12，分别加入5 mL糖原磷酸化酶a溶液溶解；另外设置对照组，称取10 mg葡萄糖、糖原、GD、GD-VB12以及1 mg糖原磷酸化酶a，分别加入5 mL PBS溶液(pH=6.8)溶解。将上述溶液置于37 ℃水浴恒温箱中振荡1 h，滴加5 mL新配制的银氨溶液，70 ℃水浴加热3 min，拍照。

2 结果与讨论

2.1 GD和GD-VB12衍生物的合成及结构分析

本工作采用CDI活化法，于室温下合成GD衍生物(图1)。图2为糖原和GD衍生物的FTIR谱图，对比糖原的FTIR谱图(图2a)，GD衍生物的FTIR谱图中在1 709 cm-1处出现了新的较强吸收峰(图2b)，该峰归属为DETA偶联在糖原上所形成的氨基甲酸酯键的羰基吸收峰[29]，表明DETA基团通过氨基甲酸酯键与糖原分子发生偶联。

图2 糖原和GD衍生物的FTIR谱图Fig.2 FTIR spectra of glycogen and the GD derivative

糖原的1H NMR谱图中(图3a)，H1质子的共振峰出现在5.0～5.5区域，3.0～4.5区域的多重峰归属为H2～H6质子的共振峰。相比之下，GD衍生物的1H NMR谱图中除了出现糖原质子的共振峰外(图3b)，还出现了DETA基团的—CH2—核磁共振峰(3.0～3.5：—CONH—CH2—；2.5～3.0：—CH2—NH2)，进一步证实DETA基团与糖原分子发生偶联[30]。采用1H NMR积分法，对DETA基团的—CH2—NH2核磁共振峰(2.5～3.0)以及糖原H1质子的共振峰(5.0～5.5)积分，可计算出GD衍生物中DETA基团的取代度(定义为糖原分子中平均每个糖单元上含有DETA基团的数目)为0.9。

在GD-VB12衍生物的1H NMR谱图中(图3c)，除了出现了DETA基团的特征峰之外，在0.3～1.3、2.1～2.5和5.9～7.2区域还出现了VB12基团质子的特征峰(星号标记峰)[31]，证明DETA和VB12基团均与糖原分子发生偶联。由于VB12基团核磁峰的强度较弱，本工作采用UV-vis法测定GD-VB12衍生物中VB12基团的取代度。图4为VB12和GD-VB12衍生物UV-vis谱图，它们在360 nm出现了VB12的特征吸收峰，根据VB12在λ=360 nm得出的工作曲线(公式1)，可计算出GD-VB12衍生物中VB12基团的取代度约为0.6%。

GD-VB12衍生物中DETA基团的取代度与我们报道的偶联DETA基团阳离子支链淀粉衍生物(DETA-Amp)的DETA基团取代度(1.0)基本一致[30]，DETA-Amp能与质粒DNA形成的纳米复合物，由糖原与支链淀粉的结构较为类似，因此，GD-VB12有可能与含负电荷基团的水溶性药物(例如核酸类药物等)形成纳米复合物。GD-VB12衍生物中VB12基团取代度与文献报道的含VB12基团的葡聚糖-聚氧乙烯烷基醚接枝共聚物以及我们合成的含VB12基团两亲性壳聚糖衍生物(Chit-DC-VB12)的VB12基团取代度(0.3%)较为接近[20,32]，这两种含VB12的聚合物均显示出较好的小肠粘膜靶向吸收性能。所以，GD-VB12衍生物在递送含负电荷基团的水溶性药物、提高其小肠靶向吸收性能方面显出一定的应用前景。

图3 1H NMR谱图 (500 MHz，D2O，298 K)(a) 糖原；(b) GD衍生物；(c) GD-VB12衍生物；(d) VB12Fig.3 1H NMR spectra (500 MHz，D2O，298 K) of (a) glycogen; (b) the GD derivative; (c) the GD-VB12 derivative; (d) VB12

图4 (a) VB12和(b) GD-VB12衍生物的UV-vis谱图 (溶剂：蒸馏水)Fig.4 UV-vis spectra of (a) VB12 and (b) the GD-VB12 derivative in distilled water

2.2 GD和GD-VB12衍生物的微观形态

图5为GD和GD-VB12衍生物的扫描电镜照片，可观察到两种糖原衍生物在水溶液中呈现一种球状粒子，粒径约为200～300 nm左右，该结果与文献报道的人体内肝糖原聚集体的粒径较为接近[14]。因此，GD-VB12衍生物有可能成为口服药物的纳米传输载体材料。

图5 (a) GD衍生物和(b) GD-VB12衍生物纳米粒的SEM照片Fig.5 SEM images of nanoparticles of (a) GD derivative and (b) GD-VB12 derivative

2.3 糖原衍生物在模拟消化道液的稳定性能

作为口服纳米药物的载体，GD-VB12衍生物在消化道系统的稳定性至关重要。据文献报道糖原能与碘形成复合物[27]，本工作采用该方法研究糖原及其衍生物在模拟消化道液中的稳定性。此外，根据葡萄糖及葡萄糖衍生物因含有具有还原性的半缩醛基端基，可使Ag+还原成Ag的原理(即银镜反应)，本工作进一步研究GD和GD-VB12衍生物在模拟消化道液中的稳定性能。

糖原及其衍生物经过模拟胃液处理且与I2-KI显色剂反应后溶液的UV-vis谱图如图6所示。从图6a～c的UV-vis谱图中可以看出，糖原及其衍生物经过含有胃蛋白酶及无胃蛋白酶的模拟胃液处理后溶液的UV-vis谱图变化不大，表明糖原及其衍生物在模拟胃液中较为稳定。此外，糖原及其衍生物在含有胃蛋白酶的模拟胃液放置3 h加入银氨溶液后均未出现银镜反应现象(图6d:③④⑤)，进一步证实它们基本上没有被胃蛋白酶和胃酸降解生成具有还原性的葡萄糖。图6e显示出糖原及其衍生物经过含有胃蛋白酶的模拟胃液处理后的保留率基本保持在90%以上，更加证明它们在模拟胃液中具有较高的稳定性。这些结果表明糖原衍生物将有可能作为口服药物载体携带药物较为安全地通过胃而进入小肠部位。

图6 (a)糖原在模拟胃液放置不同时间后加入I2-KI显色剂的UV-vis谱图；(b) GD衍生物在模拟胃液放置不同时间后加入I2-KI显色剂的UV-vis谱图；(c) GD-VB12衍生物在模拟胃液放置不同时间后加入I2-KI显色剂的UV-vis谱图；(d) 银镜反应照片：对照组(无胃蛋白酶的模拟胃液)：① 葡萄糖，② 糖原, 实验组(模拟胃液)：③ 糖原，④ GD衍生物，⑤ GD-VB12衍生物; (e) 糖原及其衍生物在模拟胃液中的保留率与时间的关系图Fig.6 (a) UV-vis spectra of glycogen incubated with the simulated gastric juice at different times after adding I2-KI solution; (b) UV-vis spectra of the GD derivative incubated with the simulated gastric juice at different times after adding I2-KI solution; (c) UV-vis spectra of the GD-VB12 derivative incubated with the simulated gastric juice at different times after adding I2-KI solution; (d) Photos of silver mirror reactions: control group (in simulated gastric medium without pepsin): ① glucose, ② glycogen; Experimental group (in simulated gastric medium): ③ glycogen, ④ the GD derivative and ⑤ the GD-VB12 derivative; (e) Relationship between retention ratio and time of glycogen and its derivatives in simulated gastric juice

糖原及其衍生物经过模拟小肠液处理且与I2-KI显色剂反应后溶液的UV-vis谱图如图7所示。从图7a可以看出，与糖原经过无胰酶的模拟小肠液处理后溶液的UV-vis谱图相比，随着糖原在含胰酶模拟小肠液中时间的增加，在波长为400 nm处的糖原-碘复合物吸收峰不断减弱，表明糖原在胰酶的作用下不断发生降解。在图7d的照片中，可观察到糖原在含有胰酶的模拟小肠液放置4 h加入银氨溶液后出现了明显的银镜反应现象(7d:③)，表明糖原已被胰酶降解生成具有还原性的葡萄糖，这与文献报道的糖原能被胰酶中含有的糖苷酶降解一致[33]。

相比之下，GD及GD-VB12衍生物经过含有胰酶及无胰酶的模拟小肠液处理后溶液的UV-vis谱图变化不大(图7b～c)，表明这些衍生物在含有胰酶的模拟小肠液中较为稳定。此外，从图7d:④和图7d:⑤的照片中可看到两种糖原衍生物在含有胰酶的模拟小肠液放置4 h加入银氨溶液后均未出现了明显的现象，表明GD及GD-VB12衍生物并没有被胰酶降解生成具有还原性的葡萄糖，即它们在模拟小肠液中较为稳定。图7e的结果表明，经过含有胰酶的模拟小肠液处理后的糖原溶液保留率随着时间的增加而不断降低，4 h后的保留率低于10%；而GD及GD-VB12衍生物溶液保留率随着时间的增加变化不大，4 h后的保留率仍然较高(均超过80%)。胰酶中含有胰淀粉酶(属于α-淀粉酶)，作为一种内切葡萄糖苷水解酶，胰淀粉酶可随机地作用于含糖原的α-1,4-糖苷键，使糖原发生水解生成葡萄糖。然而，GD-VB12衍生物的DETA和VB12基团对其糖原主链的α-1,4-糖苷键起到了一定的保护作用，所以，在模拟小肠液中GD-VB12衍生物被胰酶降解的程度低于糖原，即GD-VB12衍生物比糖原体现出更高的稳定性。因此，GD及GD-VB12衍生物将有可能作为口服药物载体携带药物较为安全地存在于小肠部位，有利于进一步被小肠吸收而进入体循环。

2.4 糖原衍生物的被糖原磷酸化酶a降解的性能

作为口服纳米药物的载体，GD-VB12衍生物携带药物被小肠吸收、进入体循环，降解后才能充分地发挥其作用。糖原主要存在于肝脏和肌肉，能被糖原磷酸化酶、糖原脱支酶和磷酸葡萄糖变位酶降解[14]。本工作采用上述碘复合物显色法和银镜反应研究了具有活性的糖原磷酸化酶a对糖原、GD和GD-VB12衍生物的降解性能。

糖原及其衍生物在糖原磷酸化酶a溶液中的结果如图8所示，与糖原、GD和GD-VB12衍生物经过无糖原磷酸化酶a的PBS (pH=6.8)处理后溶液的UV-vis谱图相比，它们在糖原磷酸化酶a/PBS (pH=6.8)溶液中放置1 h后，在波长为400 nm处的糖原-碘复合物吸收峰强度已经变得很弱，表明糖原及其衍生物在糖原磷酸化酶a的作用下快速发生降解。在图8d的照片中，可观察到糖原、GD和GD-VB12衍生物糖原在糖原磷酸化酶a/PBS (pH=6.8)溶液放置1 h加入银氨溶液后均出现了明显的银镜反应现象(7d:④⑥⑧)，表明糖原及其衍生物已被糖原磷酸化酶a降解生成具有还原性的葡萄糖。因此，GD及GD-VB12衍生物将有可能作为口服药物载体被小肠吸收而进入体循环后，在肝脏和肌肉定位释放药物。

3 结 论

本工作合成出偶联VB12基团的阳离子糖原衍生物(GD-VB12)，其在水中能形成纳米粒，将作为口服纳米药物的载体材料。GD-VB12衍生物在模拟胃液和小肠液中稳定性较高，有利于携带口服药物安全地通过消化道。GD-VB12衍生物能快速被糖原磷酸化酶a降解。因此，GD-VB12衍生物将有可能作为口服药物载体被小肠吸收而进入体循环后，在肝脏和肌肉定位释放药物。由于GD-VB12衍生物含有—NH2和—NH—正电荷基团，因此，有可能与含负电荷基团的水溶性药物(例如核酸类药物等)通过静电相互作用形成复合物，提高这些药物口服给药的生物利用度。